基于不同靶基因的熒光定量PCR 快速檢測蠟樣芽孢桿菌的研究

張志鴻，甘 蓓，譚強來，王力均，劉成偉，游興勇，許恒毅，* ，魏 華

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌330047;2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047;3.江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測院，江西南昌330029;4.江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330000)

蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是一種能產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌，廣泛分布于空氣、污水和各類生熟食品中［1］。目前，從多種食品中分離出該菌，包括炒米飯、肉類、乳類和魚等，是常見的食源性致病菌，極有可能危害人們的健康。自1950 年在挪威首次報道蠟樣芽孢桿菌可能引起人類食物中毒后，中毒事件在歐洲和北美頻繁發(fā)生［2］;在我國，蠟樣芽孢桿菌引起的中毒事件同樣嚴重，在1993～2003 十年間，蠟樣芽孢桿菌中毒者高達1758 人［3］。蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒類型主要分為腹瀉和嘔吐癥狀，其中腹瀉主要與某些菌株分泌腸毒素相關(guān)，而嘔吐主要是因某些菌株產(chǎn)生嘔吐毒素引起［4］。目前，針對蠟樣芽孢桿菌腸毒素引起的食源性疾病研究較多，檢測方法比較成熟并已經(jīng)商業(yè)化，而關(guān)于蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素的研究相對較少［5］。然而，嘔吐型蠟樣芽孢桿菌引發(fā)的食物中毒，尤其是米飯類的中毒事件時有發(fā)生。在美國，食用炒米飯發(fā)生中毒的主要原因是其中污染了產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌［6］。2006年，在德國，17 個小孩因誤食被蠟樣芽孢桿菌污染的米飯出現(xiàn)集體嘔吐癥狀［7］;2008 年，美國母子三人因食用了室溫放置1d 后再加熱的米飯而出現(xiàn)嘔吐癥狀，并導(dǎo)致其中一個1 歲的男孩死亡，最后證實為產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌污染所導(dǎo)致的食物中毒［8］。因此，建立一種快速、靈敏的方法檢測食品中產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌至關(guān)重要。當前蠟樣芽孢桿菌的常規(guī)檢測方法主要是傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法，整個過程耗時耗力，而且容易造成大量錯誤識別以及低估食源性疾病爆發(fā)的程度［9］。熒光定量PCR 于1995 年由美國PE 公司推出，因該技術(shù)實現(xiàn)了PCR 從定性到定量的飛躍，且與常規(guī)PCR 技術(shù)相比，具有特異性更強、靈敏度更高、重復(fù)性好和能定量檢測等優(yōu)點而被迅速應(yīng)用到致病菌的快速檢測領(lǐng)域［10］。本研究同時針對編碼蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素合成酶的基因cesB［4］和旋轉(zhuǎn)酶B 亞基的基因gyrB［11］設(shè)計特異性引物，結(jié)合熒光定量PCR 快速準確的優(yōu)點，首次建立了一種基于不同靶基因的快速定量檢測污染食品中產(chǎn)和不產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌(emetic Bacillus cereus，JDZ102Y 與P20063L)、不產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌(non - emetic B. cereus，DA0016L、DA96L、FX0076LY、FX0088Y、JA0056、JA0125LY、JJ0374LY、JJ0398、JX0060Y、JX0067Y、NC0001L、NC0084LY、P20078L、PX0026L1、SRX00 和YS0024L) 江西省疾病預(yù)防控制中心;粘質(zhì)沙雷氏菌(CMCC41002)、副溶血性 弧 菌 (PVPA0155 )、普 通 變 形 桿 菌(CMCC49101)、藤黃微球菌(CMCC28001)、大腸桿菌 O157 ∶H7 (NCTC12900)、銅綠假單胞桿菌(CMCC10104)、沙門氏菌(ATCC13076)、金黃色葡萄球菌(CMCC26001) 本實驗室保存;0.01mol/L PBS、2 ×TaqMix、ROX Reference Dye、SYBR Primer Ex Taq等 日本TaKaRa 公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

ABI 7900HT 實時熒光定量PCR 儀 Applied Biosystems，USA;凝膠成像系統(tǒng)Bio-Rad USA;普通PCR 儀 Eppendorf，Germany;高速離心機 Eppendorf，Germany。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 挑取產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌JDZ102Y 的單菌落接種于5mL LB 液體培養(yǎng)基，37℃、180r/min 培養(yǎng)12h。培養(yǎng)結(jié)束后，移取1mL 菌液于1.5mL 無菌離心管中，12000 ×g 離心5min，棄上清，PBS(0.01mol/L pH7.4)洗滌兩次后，等體積PBS重懸，制得菌懸液備用。

1.2.2 活菌計數(shù) 對1.2.1 制備的菌懸液進行系列十倍梯度稀釋，選取不同梯度的稀釋菌液100μL 分別均勻涂布于LB 平板，37℃倒置培養(yǎng)24h 后，統(tǒng)計平板上長出的菌落數(shù)。

1.2.3 基因組DNA 的提取 將1.2.1 制備的菌懸液沸水浴10min，使細菌裂解、DNA 釋放，隨后迅速冷卻至室溫，12000 ×g 離心5min，上清轉(zhuǎn)移至新的1.5mL無菌離心管，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank 所收錄的cesB 序列(ID:AY691650.1)和 gyrB 序列(ID:CP000001.1)，通過BLAST 比對，找出蠟樣芽孢桿菌的特異性序列;分別采用Primer 6.0 軟件設(shè)計特異性引物，交由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成(引物序列見表1)。

表1 引物序列及擴增產(chǎn)物長度Table 1 The sequence of primers and the length of amplification products

1.2.5 引物特異性的驗證 按照1.2.1 方法對所有菌株進行培養(yǎng)，按照1.2.3 方法提取基因組DNA。分別對所有菌株進行PCR，以驗證表1 中引物的特異性。PCR 體系為10μL:5μL 2 ×Taq Mix，0.2μL 上、下游引物，2μL 模板，補加去離子水至10μL。PCR 反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10min;94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進行30 個循環(huán)，再72℃終延伸10min。PCR 產(chǎn)物用經(jīng)過GoldView 核酸染色的1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳。用GelDoc XR 凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.2.6 熒光定量PCR

1.2.6.1 標準曲線的建立 取1.2.1 制得菌懸液進行系列十倍梯度稀釋，取6 個連續(xù)梯度濃度的菌液，按照1.2.3 方法提取基因組DNA，采用上述兩對引物分別進行熒光定量PCR?？偡磻?yīng)體系為20μL:10μL 2×SYBR Primer Ex Taq，上、下游引物各0.8μL，0.4μL ROX Reference Dye，2μL 模板，補加去離子水至20μL。陰性對照為2μL 去離子水代替模板加入反應(yīng)體系。擴增反應(yīng)條件:95℃30s;95℃5s、58℃1min，進行40 個循環(huán);95℃15s、60℃15s、95℃15s。

1.2.6.2 人工污染食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測 從當?shù)爻匈徺I新鮮米飯，經(jīng)傳統(tǒng)平板計數(shù)法檢測證明無蠟樣芽孢桿菌污染。稱取25g 米飯樣品于225mL LB 培養(yǎng)基，加入已知濃度的產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌，使得米飯培養(yǎng)基混合液樣品中細菌最終濃度分別為100、101、102、103、104和105CFU/g?；旌弦?00 ×g 離心1min，去掉米飯殘渣，取1mL 上清液于1.5mL 無菌離心管中，12000 ×g 離心5min，棄上清，PBS 洗滌兩次后，等體積無菌水重懸，按照1.2.3方法提取基因組DNA。

2 結(jié)果與討論

2.1 活菌計數(shù)

待涂布的LB 平板上長出清晰單菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)，換算取平均值。結(jié)果表明1.2.1 制得菌懸液的濃度為1.2 ×108CFU/mL。

2.2 引物特異性驗證

以各菌株的基因組DNA 作為模板，分別用能編碼蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)嘔吐毒素合成酶的結(jié)構(gòu)基因cesB和蠟樣芽孢桿菌具有高度特異性的DNA 旋轉(zhuǎn)酶的B亞基的基因gyrB 設(shè)計引物，利用常規(guī)PCR 技術(shù)對引物進行特異性分析，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，采用cesB 引物，只有JDZ102Y 和P20063L 這兩株產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌能擴出154bp 的特異性條帶，其它蠟樣芽孢桿菌無擴增條帶;采用gyrB 引物，所有的蠟樣芽孢桿菌均能擴出114bp 的特異性條帶，而非蠟樣芽孢桿菌以及陰性對照均無擴增條帶，見表2。表明所設(shè)計的引物對蠟樣芽孢桿菌具有很強的特異性，能區(qū)分出產(chǎn)嘔吐毒素還是不產(chǎn)毒蠟樣芽孢桿菌，與其它非蠟樣芽孢桿菌無交叉，因此，這兩對特異性引物可用來構(gòu)建熒光定量PCR 方法。本研究選用產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌JDZ102Y 進行后續(xù)實驗。

表2 菌株及引物特異性驗證Table 2 Bacteria strains and the specificity of primers

2.3 不同引物擴增的標準曲線的建立

將1.2.1 所獲得菌懸液進行系列稀釋，取含101、102、103、104、105、106CFU/mL 的稀釋液按1.2.3 方法提基因組DNA，取2μL 進行定量PCR 擴增，根據(jù)菌落計數(shù)的結(jié)果可以推算出稀釋液的濃度分別為1.2×107、1.2 ×106、1.2 ×105、1.2 ×104、1.2 ×103和1.2 ×102CFU/mL，以此菌液提基因組DNA 進行熒光定量PCR 實驗，則PCR 體系中模板的濃度分別為1.2 ×106、1.2 ×105、1.2 ×104、1.2 ×103、1.2 ×102和1.2 ×101CFU/mL。建立Ct 值與模板濃度的標準曲線，如圖1。采用cesB 引物的標準曲線的回歸方程為:Y =-3.3347X +34.102，相關(guān)系數(shù)為0.9956，擴增效率為99.4%。;采用gyrB 引物的標準曲線的回歸方程為:Y =-3.3354X +35.341，相關(guān)系數(shù)為0.9972，擴增效率為99.5%兩條標準曲線的斜率分別為-3.3347和-3.3354，在-3.1 ～-3.5 的合理范圍內(nèi)。從圖1 可知，利用純培養(yǎng)提取的相同濃度的模板，基于不同靶基因進行的熒光定量PCR 所獲得的Ct 值相差不大，靶基因cesB 和gyrB 擴增效率均高于99%，相關(guān)系數(shù)都大于0.99，說明熒光定量PCR 擴增接近理想擴增，該方法對樣品測定結(jié)果準確，可用于對實際污染樣品的檢測。

圖1 基于不同引物擴增的標準曲線Fig.1 The standard curve based on different primers

2.4 人工污染實際樣品中蠟樣芽孢桿菌的檢測限

為了模擬受污染天然食品的檢測，取不同梯度稀釋的蠟樣芽孢桿菌接種到米飯樣品中，提基因組DNA，進行熒光定量PCR 檢測。根據(jù)Ct 值和圖1 不同引物擴增的標準曲線計算出不同引物條件下檢測出的菌液濃度。每次實驗進行三次重復(fù)，結(jié)果如表3所示。米飯中蠟樣芽孢桿菌污染濃度為100CFU/g時，熒光定量PCR 不能檢測出該菌;污染濃度超過101CFU/g 菌液時，熒光定量PCR 能獲得相應(yīng)的Ct值，能檢測出對應(yīng)濃度的蠟樣芽孢桿菌。從實際樣品獲取的同一模板，兩組引物進行的熒光定量PCR檢測結(jié)果相似，然而當米飯中污染濃度為105CFU/g時，采用cesB 引物進行擴增，得到的平均Ct 值為20.68，再結(jié)合圖1，每個模板的Ct 值與起始拷貝數(shù)的對數(shù)之間存在線性關(guān)系，利用此線性關(guān)系可以定量計算出污染米飯中蠟樣芽孢桿菌的濃度為1.06 ×105CFU/g，而采用gyrB 引物進行的擴增，得到的平均Ct 值為22.16，再根據(jù)標準曲線計算出的米飯污染濃度為8.95 ×104CFU/g;基于靶基因gyrB 進行的熒光定量PCR 所獲得的Ct 值大于靶基因cesB 引物獲得的Ct 值，可能與食品基質(zhì)對gyrB 擴增效率造成一定影響有關(guān)，然而，它們的檢測靈敏度是一致的，只有食品基質(zhì)中蠟樣芽孢桿菌的濃度高達105CFU/g時，基于gyrB 靶基因的檢測濃度為8.95 ×104CFU/g，而基質(zhì)中菌的濃度為101、102、103、和104CFU/g 均能定量檢測出來對應(yīng)濃度，結(jié)果表明檢測效率較高。本研究基于不同靶基因進行的熒光定量PCR 均能檢測到米飯中101CFU/g 的蠟樣芽孢桿菌。Ombui［12］利用多重PCR 技術(shù)對蠟樣芽孢桿菌污染的米飯進行檢測所獲得檢測限為4 × 104CFU/g，Lim 等［13］利用nheA、groE 和ces 構(gòu)建的熒光定量PCR 對蠟樣芽孢桿菌污染的豆醬檢測時的檢測限為(7.0 ± 0.2)×102CFU/g，說明本研究構(gòu)建的基于不同靶基因的檢測方法檢測靈敏度比Lim 及Ombui 等的要高。

3 結(jié)論

蠟樣芽孢桿菌是一種常見的食源性致病菌，目前已被挪威和荷蘭認定為食品中最容易檢出的病源微生物［14］。蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒大多是由于食物熱加工處理和冷藏不當而引起芽孢大量繁殖，而中毒對象以小孩為主［7，15］。產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌引起食物中毒反應(yīng)較快(0.5～5h)［3］，而癥狀一般比較溫和，加之與其它病菌引起的中毒癥狀非常相似，因此該菌引起的食物中毒往往容易被人們所忽視、甚至發(fā)生誤診［16］。隨著我國乳品工業(yè)、快餐、學(xué)生套餐和嬰兒食品等的快速發(fā)展，蠟樣芽孢桿菌對這些食品的威脅很大，有可能引起大規(guī)模中毒事件的爆發(fā)［17］，因此，建立一種快速、準確檢測蠟樣芽孢桿菌的方法至關(guān)重要。

表3 污染米飯中蠟樣芽孢桿菌的檢測Table 3 Detection of B.cereus in rice

本研究構(gòu)建的熒光定量PCR 方法具有特異性強、靈敏度高和能準確定量等優(yōu)點。對不同濃度污染的米飯進行檢測，當米飯中蠟樣芽孢桿菌濃度為100CFU/g 時，該方法檢測不到菌;當污染濃度超過101CFU/g 時，該方法能有效檢測，且能對污染的菌液濃度進行準確定量，檢測限能達到101CFU/g。通過基于不同靶基因?qū)ο灅友挎邨U菌進行檢測，能快速靈敏地識別產(chǎn)嘔吐毒素或者不產(chǎn)毒蠟樣芽孢桿菌，全程時間僅需3h(包括取樣、前期處理和熒光定量PCR)，比分別對產(chǎn)嘔吐毒素和不產(chǎn)毒蠟樣芽孢桿菌進行檢測縮短了檢測周期，為食品污染的檢測和蠟樣芽孢桿菌中毒的快速反應(yīng)提供技術(shù)支持。

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