商用大豆分離蛋白乳化活性的優(yōu)化

黃行健，高 麗，章肇敏，黎揚(yáng)帆，徐曉云，王可興，潘思軼，*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院，食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢430205;3.江西金源農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，江西宜春336100)

人們對(duì)蛋白質(zhì)的物化特性、營(yíng)養(yǎng)性和生物活性了解越來越多。作為許多配方食品的功能性成分，蛋白質(zhì)加工和應(yīng)用學(xué)科變得越來越重要［1］。許多研究通過酶改性方法改進(jìn)分離蛋白的功能性。天然大豆蛋白具有乳化性、起泡性、保水性、凝膠性等物化性質(zhì)。但是其物化性質(zhì)離人類實(shí)際應(yīng)用的要求還有一定差距，這主要有兩方面原因:a.一種天然的大豆蛋白難以兼具多種優(yōu)良的物化性質(zhì);b.天然大豆蛋白的物化性質(zhì)離人類要求的水平經(jīng)常還有差距，難以實(shí)際應(yīng)用于產(chǎn)品中，酶解改性是目前很常用的手段，不同的酶有特定的水解多肽構(gòu)架中的肽鍵，水解生成許多中等和小分子量大豆肽，由于暴露出更多的氨基和羧基，提高天然蛋白質(zhì)的親水性［2］和分散性［3］。限制性水解也伴隨其他功能特性的改變，亞基解離，蛋白質(zhì)致密結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部的疏水區(qū)域暴露，墑增加，表面活性增強(qiáng)［4］。目前植物蛋白質(zhì)利用的主要瓶頸是水解過程中的抵抗作用，這也是導(dǎo)致蛋白質(zhì)組分氨基酸可利用性不高的主要原因［5］。像許多植物蛋白質(zhì)一樣，大豆蛋白對(duì)于許多水解蛋白酶也有抵抗作用。與其他常用酶制劑比較，胰蛋白酶的專一性強(qiáng)，水解的重復(fù)性高，能顯著地提高酶解蛋白的乳化性能［6］。胰蛋白酶的催化位點(diǎn)是賴氨酸、精氨酸中的酰胺鍵，水解蛋白中只有少數(shù)的酰胺鍵被水解，產(chǎn)物主要是由離解的亞基、部分水解的蛋白和一些分子量較大的大豆肽組成［7］。胰蛋白酶在動(dòng)物蛋白(魚下腳料，蛋黃蛋白、豬骨蛋白)和植物蛋白(大豆蛋白，豌豆蛋白，米蛋白、乳清蛋白，甘薯蛋白、棉籽蛋白、小米蛋白、核桃蛋白)都得到了很好的應(yīng)用和嘗試，但是即使是同一種底物蛋白，由于提取，純化，生產(chǎn)蛋白等過程的不同，所得的酶解參數(shù)和產(chǎn)品乳化活性存在差異性。大豆蛋白具有優(yōu)良的功能性質(zhì)，包括持水性、吸油性、增稠性、乳化性、起泡性［8］。乳化活性是大豆蛋白重要的物化特性之一，乳化活性指的是蛋白質(zhì)作為乳化劑，單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)在油水共存體系中能夠穩(wěn)定油水界面的面積。本文選定目前主要市售美國(guó)杜邦、山東禹王和以色列索寶的商業(yè)大豆分離蛋白粉作為供試蛋白。探索酶解時(shí)間、酶解pH、酶解溫度、酶與底物的質(zhì)量比四種因素作為影響酶解反應(yīng)的自變量，選擇乳化活性作為因變量，確定酶解大豆蛋白的最佳優(yōu)化工藝條件，對(duì)商業(yè)大豆分離蛋白的乳化活性進(jìn)一步優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白 分別購(gòu)買于山東臨邑禹王植物蛋白有限公司(樣品1)、云夢(mèng)杜邦蛋白有限公司(樣品2)和以色列索寶工業(yè)公司(樣品3);胰蛋白酶 酶活250u/mg，美國(guó)AMRESCO 生物公司;氫氧化鈉、鹽酸、十二烷基磺酸鈉等 均為市售分析純。

ZD-3A 自動(dòng)電位滴定儀 上海羽通儀器儀表廠;DF-101S 恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市科瑞儀器有限公司;1-4LD 冷凍干燥機(jī) 德國(guó)CHRIST 公司;OPTIMA LE - 80K 超速冷凍離心機(jī)美國(guó)BECKMAN COULTER 公司;Nicolet NEXUS 470 傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)尼高力公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定 凱氏半微量定氮法［9］。

1.2.2 氮溶解指數(shù)的測(cè)定 稱取1g 左右樣品，溶于50mL 純水中，在磁力攪拌器中緩慢攪拌30min 后在4000r/min 轉(zhuǎn)速下離心，取上清液5mL。凱氏定氮法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量，然后計(jì)算氮溶解指數(shù)(NSI)［10］:

1.2.3 傅里葉變換紅外光譜 樣品粉末與KBr 按1∶100比例混合后充分研磨，接著在27MPa 條件下壓2min，每個(gè)樣品壓3～5 個(gè)，壓好的片放進(jìn)FT-IR 光譜儀，密閉條件下掃描得樣品紅外光譜圖。掃描范圍為4000～400cm-1，分辨率4cm-1，累計(jì)32 次，以空氣為背景，每個(gè)樣品掃描前扣除背景［11］。

1.2.4 胰蛋白酶酶解大豆分離蛋白 制備5.0%濃度的大豆分離蛋白溶液，沸水浴中加熱處理10min，然后放入恒溫水浴鍋中按照表1 控制反應(yīng)溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間、胰蛋白酶與蛋白底物比，水解過程中不斷加入0.30mol/L NaOH 溶液維持反應(yīng)體系pH 恒定。反應(yīng)到規(guī)定時(shí)間后取出溶液，立即置于100℃水浴中加熱10min 滅酶活，然后冷卻到室溫，將酶解液置入離心機(jī)中于8000r/min 離心12min，取上清液，調(diào)節(jié)pH 至中性，將溶液轉(zhuǎn)移到透析袋中，于2℃下透析48h，透析完成后，冷凍干燥樣品，凍干樣品研磨成粉狀密封保存在玻璃瓶中，在4℃環(huán)境中密封儲(chǔ)存待用。

1.2.5 乳化活性的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取0.0180g 酶解大豆蛋白，加入18mL 水，6mL 油，中等轉(zhuǎn)速下均質(zhì)1min，分別于均質(zhì)后0min 和10min 取底層乳液100μL 加入到10mL 的0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液中。以0.1%SDS 液為空白，在500nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。采用Tang 的方法［13］測(cè)定乳化活性，公式如下:

EAI-單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的乳化表面積(m2/g);c-樣品溶解液中蛋白質(zhì)濃度(g/mL);φ-油相所占的分?jǐn)?shù)，本實(shí)驗(yàn)為1/4;L-比色皿的光徑(10-2m)。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平對(duì)照Table 1 Experimental factors and levels in control

2 結(jié)果與分析

2.1 三種不同來源大豆分離蛋白粉分析

2.1.1 粗蛋白含量和氮溶解指數(shù) 商業(yè)化的大豆分離蛋白是調(diào)節(jié)脫脂大豆粉萃取液至pH4.3～4.8 而沉淀出來的［14］。大豆蛋白主要是由β-伴大豆球蛋白(7S)和大豆球蛋白(11S)組成，但是其中也包含一些與卵磷脂連接的親脂性蛋白質(zhì)，三者比例約為23%、46%和31%。這三者的比例隨著大豆蛋白的氮溶解指數(shù)(NSI)變化而變化。不像7S 球蛋白和11S 球蛋白，親脂性蛋白質(zhì)的含量與大豆蛋白的NSI 值成正相關(guān)［15］。大豆蛋白是球蛋白，肽鏈上親水性側(cè)鏈基團(tuán)大部分在分子表面，形成親水區(qū)域;而肽鏈側(cè)鏈上的疏水基團(tuán)埋藏在內(nèi)部，形成疏水區(qū)。所以當(dāng)大豆蛋白的親水性鹽鍵和酯鍵處于分子表面，則具有較好的親水性［16］。但是蛋白質(zhì)容易受物理或化學(xué)因素的影響而變性，蛋白質(zhì)四維結(jié)構(gòu)由致密的球狀變?yōu)槭杷傻陌魻?，?nèi)部的疏水側(cè)鏈殘基暴露出來，導(dǎo)致溶解性下降［17］。氮溶解指數(shù)主要用來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)在水中的溶解性，被廣泛地應(yīng)用于評(píng)價(jià)大豆蛋白的品質(zhì)和變性程度［18］。

如表2 所示，不同來源大豆分離蛋白中蛋白質(zhì)含量和NSI 值存在一定的差異。美國(guó)杜邦、山東禹王和以色列索寶產(chǎn)的大豆分離蛋白中的蛋白質(zhì)含量分別為86.1%、89.8% 和88.8%，NSI 值分別為47.6%、66.1%和42.7%。結(jié)果表明:山東禹王產(chǎn)的大豆分離蛋白的蛋白質(zhì)含量和NSI 值最高。大豆蛋白的乳化性與表面疏水性、溶解性、分子量、空間構(gòu)型、分子柔性等有關(guān)。較好的溶解性是良好乳化性能的必要條件之一，并且NSI 值高，有利于進(jìn)行酶修飾改變蛋白質(zhì)功能性質(zhì)。

表2 粗蛋白含量和氮溶解指數(shù)Table 2 Crude protein content and nitrogen solution index

2.1.2 傅里葉紅外圖譜分析 在蛋白質(zhì)分子酰胺Ⅰ帶中，波數(shù)1650～1658cm-1為蛋白質(zhì)分子的α-螺旋特征譜帶，峰積分面積為α-螺旋含量;波數(shù)1610～1640cm-1為蛋白質(zhì)分子的β-折疊。在蛋白質(zhì)分子酰胺Ⅲ帶中，波數(shù)1290 ～1340cm-1為蛋白質(zhì)分子的α-螺旋特征譜帶，1181～1248cm-1為β-折疊特征譜帶，1255 ～1288cm-1為無規(guī)卷曲特征譜帶［19］。如圖1～圖3所示，經(jīng)過Peakfit 軟件分析紅外數(shù)據(jù)，三種不同大豆分離蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)所占比例大于β-折疊，二級(jí)結(jié)構(gòu)組成大體相似，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量多少依次為:山東禹王＞云夢(mèng)杜邦＞以色列索寶，許多學(xué)者研究表明大豆蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量與溶解性能存在正比關(guān)系［20］，而溶解性能大小是乳化特性高低一個(gè)很重要的基礎(chǔ)，溶解性高，有利于乳化性的提高。

圖1 美國(guó)杜邦大豆分離蛋白Fig.1 SPI of DuPont Co.，Ltd

圖2 山東禹王大豆分離蛋白Fig.2 SPI of Shandong Yuwang Industrial Co.，Ltd

圖3 以色列索寶大豆分離蛋白Fig.3 SPI of Solbar Industrial Co.，Ltd

綜合以上分析，后期實(shí)驗(yàn)采用山東禹王公司生產(chǎn)的商用大豆分離蛋白作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的供試蛋白。

2.2 四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)

采用四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)研究加酶量、溫度、時(shí)間和pH 對(duì)酶解大豆分離蛋白乳化活性的影響。酶解工藝條件及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果Table 3 Experimental arrangements and results

2.3 回歸方程分析與最優(yōu)酶解條件確定

回歸方程的方差分析、方程各項(xiàng)方差及顯著性分析、最大乳化活性的酶解工藝參數(shù)及其結(jié)果如表4～表7所示。

各因素對(duì)水解產(chǎn)物乳化特性的影響程度從大到小的依次排列為:溫度＞pH ＞時(shí)間＞加酶量。胰蛋白酶水解大豆分離蛋白，以乳化活性為因變量的回歸方程為:EAI = -842.619 + 46.526A + 14.090B +17.759C + 108.685D-14.647A2-0.111AB-0.114B2-0.553AC + 0.143BC-3.10C2+ 4.514AD-0.538BD +0.399CD-5.596d2。由方程的顯著性分析得F 為22.23，p 小于0.0001，方程具有良好的回歸性。

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance in regression equation

表5 回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation

表6 二次回歸模型參數(shù)Table 6 Parameters of regression equation

表7 酶解條件優(yōu)化值及最優(yōu)條件下最大的乳化活性Table 7 Optimizations of enzyme digestion and maximal emulsifying activity index

原始大豆分離蛋白的乳化活性為12.82m2/g。如表7 所示，當(dāng)加酶量、溫度、時(shí)間與pH 分別為2.72%、40℃、4.12h、8.85 時(shí)，該條件下水解得到的酶解大豆蛋白乳化活性最大，為22.57m2/g。

3 結(jié)論

當(dāng)加酶量、溫度、時(shí)間與pH 分別為2.72%、40.34℃、4.12h、8.85 時(shí)，SPI 水解物的EAI 最大，為22.57m2/g。1 號(hào)大豆蛋白水解物乳化活性得到很大的改善，酶解大豆蛋白的最大乳化活性比大豆分離蛋白的乳化活性上升76%。

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