一株章魚腸道共生菌的篩選鑒定及抑菌譜研究

鄧加聰，鄭 虹，陳文韜

(福建師范大學(xué)福清分校，福建福清350300)

微生物資源及其產(chǎn)生的活性化合物是地球上最為豐富的自然資源之一，是藥物發(fā)現(xiàn)的重要來源。在目前陸地微生物發(fā)現(xiàn)新藥幾率急劇下降的形勢下，海洋微生物次生代謝產(chǎn)物特別是海洋稀有放線菌已成為作用機(jī)制新穎、化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣化的新藥先導(dǎo)化合物的來源［1-3］。目前我國對海洋稀有放線菌及其產(chǎn)生的活性化合物研究不多，總體水平較低。但是，有關(guān)海洋生物產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)的報(bào)道逐漸增多，已經(jīng)從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)新穎的化合物，這些化合物具有較高的抗腫瘤活性。海洋放線菌是海洋細(xì)菌抗腫瘤活性物質(zhì)的重要來源，最先成為海洋微生物研究的熱點(diǎn)［4-6］。動(dòng)物腸道微生物對于特定的動(dòng)物生長發(fā)育而言是一種整體的、全面的、平衡的群體。近年來，隨著對腸道共生菌研究的不斷深入，腸道共生菌的多種生物學(xué)功能不斷被發(fā)現(xiàn)，如腸道共生菌產(chǎn)生的多種抗生素對多種植物及人類病原菌有廣泛的抑菌活性;產(chǎn)生的殺蟲毒素對許多害蟲有較強(qiáng)的致死作用等，體現(xiàn)出廣闊的開發(fā)利用前景［7-9］。因此，對動(dòng)物腸道中海洋微生物的研究具有很好的發(fā)展前景，為尋求新的藥物或者抑菌物，本文對無脊椎動(dòng)物章魚腸道中的共生菌進(jìn)行篩選、觀察、16S rDNA 鑒定、抑菌譜研究等，來了解章魚腸道中共生菌的抑菌情況，以便進(jìn)一步開發(fā)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

活章魚 購買自自福清市東壁島海產(chǎn)品市場;大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黃八疊球菌(Sarcina lutea)、白色念珠菌(Monilia albicans)、短小桿菌(Bacillus pumilis)、青枯病菌(Bacterial wilt)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、青霉、木霉、根霉、黑曲霉、黃曲霉、玉米病菌 福建師范大學(xué)福清分校生化系微生物實(shí)驗(yàn)室提供;Taq 酶、dNTP、瓊脂糖、DNA 純化試劑盒等藥品 購自上海生物工程有限公司;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA 蔗糖培養(yǎng)基、高氏I 號培養(yǎng)基 購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;分離培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基、無機(jī)鹽淀粉培養(yǎng)基、酵母膏-麥芽糖培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基 參照文獻(xiàn)《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》［10］配方自主配制。

生化培養(yǎng)箱SPX-150B-Z 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;超凈工作臺SW-CJ-IFD 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50KB 上海申安醫(yī)療器械廠;大容量恒溫振蕩器THZ-25 太倉市華美生化儀器廠;臺式低速大容量離心機(jī)L-550 湘儀離心機(jī)有限公司;PCR 儀 美國Bio-rad 公司;水平電泳槽 北京六一儀器廠;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9070A 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海洋腸道抗菌性放線菌的篩選 章魚表面用75%酒精消毒，在超凈工作臺上進(jìn)行解剖，取其腸道作為樣品，將樣品剪碎、混合，備用;稱取1g 樣品放入裝有9mL 無菌水的試管中，稀釋度即為10-1，按10倍稀釋法進(jìn)行梯度稀釋，稀釋度為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7;分別吸取不同梯度的稀釋液0.2mL，涂布于裝有分離培養(yǎng)基的平板，每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板，于28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5～7d;挑取菌落大的菌株劃線分離培養(yǎng)基，挑取單菌落接種于試管斜面28℃培養(yǎng)，并于4℃冰箱保存，備用。

1.2.2 抗菌性放線菌的復(fù)篩 將初篩得到的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃150r/min 振蕩培養(yǎng)72h，以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用雙層平板透明圈法測定發(fā)酵液的抑菌作用。

每株菌重復(fù)3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 菌株D-8 的培養(yǎng)與生理生化特征的確定 參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》［11］、《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》［12］等相關(guān)文獻(xiàn)對菌株的形態(tài)、培養(yǎng)及生理生化特性進(jìn)行鑒定。

1.2.4 16S rDNA 基因序列測定和分析

1.2.4.1 菌株基因組DNA 的提取 將活化后的菌株采用堿提取法提取菌株D-8 基因組DNA［13-14］。

1.2.4.2 16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增和測序 根據(jù)16S rDNA 的保守區(qū)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，正向引物16s-F:5'-AGAGTTTGATCATGGCCTCAG-3';反向引物16s-R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR 反應(yīng)體系(50μL)為:10 ×Tap Buffer 5μL、dNTP 1μL、PCR 引物各1μL、Taq 酶1μL、DNA 模板1μL，加無菌雙蒸水至50μL。PCR 反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min，94℃30s，55℃ 30s，72℃延伸1min，循環(huán) 35 次，72℃10min。16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，產(chǎn)物用試劑盒純化后進(jìn)行測序。

1.2.4.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 測序結(jié)果與Ncbi 的GenBank 中已知序列進(jìn)行比對，用MAGE5.2 軟件以N-J 法構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.5 菌株抑菌性實(shí)驗(yàn)及其抑菌譜實(shí)驗(yàn)1.2.5.1 抑菌性實(shí)驗(yàn) 采用雙層平板透明圈法［15］。培養(yǎng)皿中加入10mL 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(下層)，搖勻鋪平，再加入7mL 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(60℃左右含有指示菌終濃度為106個(gè)/mL)，之后迅速放入滅過菌的牛津杯，完全凝固后備用。每個(gè)杯中加入200μL 樣品，36℃下培養(yǎng)24h，觀察并測量透明圈的直徑。

1.2.5.2 抑菌譜實(shí)驗(yàn) 抗細(xì)菌活性實(shí)驗(yàn):雙層平板透明圈法(同上);抗絲狀真菌活性實(shí)驗(yàn):采用濾紙片法［16-17］，將指示菌點(diǎn)接于PDA 平板培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)24～36h，待菌落長到約5cm 左右，將浸泡有樣品的濾紙片(直徑:5mm)放至菌落外圍0.5cm 處，以無菌蒸餾水為對照，28℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 章魚腸道放線菌的篩選及菌株形態(tài)觀察

2.1.1 章魚腸道放線菌的篩選 經(jīng)過稀釋涂布及劃線分離等方法，從新鮮章魚腸道中篩選到12 株菌落大、抑菌活性較高的放線菌，結(jié)果見圖1。

圖1 不同菌株抑菌性的比較Fig.1 The compare of different strains’antibacterial

由圖1 可見，菌株8 的透明圈直徑最大，為2.61cm，說明菌株8 的抑菌活性最高。不同菌株間抑菌性的高低如下:D-8 ＞D-6 ＞D-10 ＞D-12 ＞D-2＞D-1 ＞D-11 ＞D-3 ＞D-5 ＞D-9 ＞D-7 ＞D-4，因此選擇菌株8 進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 放線菌菌株形態(tài)觀察及生理生化鑒定 參見文獻(xiàn)《放線菌快速鑒定與分類系統(tǒng)》對菌株D-8 進(jìn)行菌株形態(tài)及生理生化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖2、表1、表2。

圖2 放線菌D-8 的形態(tài)特征Fig.2 Actinomycetes’(D-8)morphological characteristics

由圖2 可見，該菌株在高氏Ⅰ號固體培養(yǎng)基上菌落較小，乳白色，干燥，不透明，難挑取。在顯微鏡下觀察，菌株菌絲不斷裂、無橫隔、具有良好的分枝菌絲。

菌株D-8 部分生理生化鑒定結(jié)果見表1、表2，該菌株革蘭氏染色為陽性，硫化氫實(shí)驗(yàn)陽性，能水解明膠、幾丁質(zhì)、酪蛋白、纖維素及淀粉，糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中不利用棉子糖;該菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)有所差別，在無機(jī)鹽淀粉培養(yǎng)基上生長會產(chǎn)生黃色可溶性色素，其他培養(yǎng)基上均不產(chǎn)可溶性色素。參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《放線菌快速鑒定與分類系統(tǒng)》中放線菌的分類方法，根據(jù)菌株的生理生化特性及在不同培養(yǎng)基上的菌絲特征初步判斷該菌株屬于鏈霉菌屬(Streplomyces)。

表1 菌株D-8 部分生理生化特性Table 1 Strain’s(D-8)part physiological and biochemical features

表2 菌株D-8 在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征Table 2 Strain’s(D-8)morphological characteristics in different mediums

2.2 放線菌D-8 的16S rDNA 的測序和分析

測序獲得菌株16S rDNA 的序列大小為1542bp，將測序所得的16S rDNA 序列通過NCBI 的BLAST進(jìn)行在線比對，結(jié)果表明該菌株的序列與鏈霉菌屬的多個(gè)鏈霉菌具有99%以上的同源性。根據(jù)同源性高低，隨機(jī)挑取若干個(gè)序列，采用MAGE5.2 軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖3。

圖3 菌株D-8 的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Strain’s(D-8)phelogenetic tree

從圖3 可見，菌株D-8 與鏈霉菌菌屬聚為一類，且與登陸號等鏈霉菌16S rDNA 序列的同源性最高達(dá)到99%。因此，在細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)上，初步將該菌株歸屬為鏈霉菌。

2.3 菌株抑菌譜的測定

2.3.1 放線菌D-8 對細(xì)菌的抑菌譜 放線菌D-8 30℃150r/min 振蕩培養(yǎng)72h，發(fā)酵液4℃8000r/min離心10min 得上清液，采用雙層平板透明圈法測定上清液對各種細(xì)菌的抑菌性。結(jié)果見圖4。

圖4 放線菌D-8 對各種細(xì)菌的抑制作用Fig.4 The inhibiting effect of Actinomycetes’(D-8)to different bacterias

由圖4 可見，放線菌D-8 對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有明顯的抑菌作用，對各種指示菌抑菌作用的強(qiáng)弱如下:金黃色葡萄球菌＞藤黃八疊球菌＞大腸桿菌＞白色念珠菌＞枯草芽孢桿菌＞青枯病菌＞短小桿菌，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌性可達(dá)到2.63cm。表明該菌株是一株具有廣譜抑菌作用的菌株。

2.2.2 放線菌D-8 對真菌的抑菌譜 放線菌D-8 30℃150r/min 振蕩培養(yǎng)72h，發(fā)酵液4℃8000r/min離心10min 得上清液，采用濾紙片法測定上清液對各種真菌的抑菌性，以濾紙片周圍的透明圈大小為判定該菌株對指示菌抑菌作用的強(qiáng)弱。結(jié)果見表3。

表3 放線菌D-8 對各種真菌的抑制作用Table 3 The inhibiting effect of Actinomycetes’(D-8)to different fungus

由表3 可見，放線菌D-8 對部分真菌有抗性，而對一些真菌無抗菌性。

3 結(jié)論

本文從章魚腸道中篩選得到一株具有抗菌活性的鏈霉菌菌株D-8。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有明顯的抑菌作用，對各種指示菌抑菌作用的強(qiáng)弱如下:金黃色葡萄球菌＞藤黃八疊球菌＞大腸桿菌＞白色念珠菌＞枯草芽孢桿菌＞青枯病菌＞短小桿菌，具有廣譜的抑菌活性。常規(guī)生理生化測試結(jié)果表明，菌落較小，乳白色，干燥，不透明，難挑取。在顯微鏡下觀察，菌株菌絲不斷裂、無橫隔、具有良好的分枝菌絲，革蘭氏染色為陽性。

從16S rDNA 基因序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育樹上看，該菌株與鏈霉菌有99%以上的同源相似性，表明該菌株與鏈霉菌菌屬的親緣關(guān)系最近。綜上所述，從形態(tài)、生理生化、16S rDNA 基因序列同源性、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)等方面分析，菌株D-8 可鑒定為海洋放線菌中的鏈霉菌，具有廣譜的抑菌活性。本研究為新化合物的尋找打下基礎(chǔ)。

［1］王海雁，劉健，趙淑江.海洋放線菌多樣性及其代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展［J］.中國海洋藥物，2010，29(1):67-75.

［2］曾湘，鄭天凌.海洋活性肽研究的回顧與展望［J］.世界科技研究與發(fā)展，2009，31(6):1012-1016.

［3］姜怡，唐蜀昆，王永霞，等.海洋放線菌分離方法［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(6):153-155.

［4］田新朋，張偲，李文均.海洋放線菌研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)報(bào)，2011，51(2):161-169.

［5］Saadoun I，Wahiby L，Ababneh Q，et al.Recovcry of soil streptomycetes from arid habitats in Jordan and their potential to inhibit multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa pathogens［J］.World Journalof Microbiolog Y and Bioteehnology，2008，24(2):157-162.

［6］Gupta J C，Pandey G，Mukherjee K J.Two-stage cultivation of recombinant Saccharomyces cerevisiae to enhance plasmid stability under non-selective conditions:experimental study and modeling［J］.Enzyme and Microbial Technology，2008，28(1):89-99.

［7］李鵬，苗增良，王健鑫，一株產(chǎn)黑褐色色素海洋放線菌的研究［J］.海洋環(huán)境科學(xué)，2011，30(5):689-693.

［8］Zhao Jian，Lan Xiao - jun，Su Jun，et al.Isolation and identification of an alkaliphilic Bacillus flexus XJU - 3 and analysis of its alkaline amylase［J］.Acta Microbiologica Sinica，2008，48(6):750～756.

［9］Gazi M R，Kanda K，Yasuda M，et al.Optimisation of culturalcoditions and some properties of radical scavenging substance from Sporobolomyces salmonicolor［J］.Pakistan Joumal of Biological Sciences，2010，7(8):1365-1370.

［10］周德慶. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］.北京:高等教育出版社，2011.

［11］布瑞德.伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊［M］. 第8 版. 北京:科學(xué)出版社，1984.

［12］阮繼生，黃英.放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類［M］.北京:科學(xué)出版社，2011.

［13］莎姆布魯克. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］. 黃培堂(譯).北京:科學(xué)出版社，2005.

［14］劉炳輝，曹遠(yuǎn)銀，閆建芳，等.6 種鏈霉菌基因組DNA 提取方法比較［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(10):86-89.

［15］滿德慧，鄧尚貴，唐艷，等.竹蓀等4 種植物提取物的抑菌效果及復(fù)配研究［J］.浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，30(2):137-141.

［16］沈碩，王艦.青海鹽湖地區(qū)嗜鹽菌的分離純化及抑制植物病原菌的活性初探［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013(1):79-81，88.

［17］王靜，楊澄然，郭芳芳，等.一株放線菌的分子鑒定與抗菌譜研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(34):20964-20967.