幾種物質(zhì)對(duì)亞硝酸鹽清除作用的比較

艾對(duì)元，張衛(wèi)兵，馮麗丹，齊燕姣，贠建民，畢 陽(yáng)，鄭惇元

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070;2.西北民族大學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州730030)

亞硝酸鹽結(jié)晶為白色粉末，易溶于水。硝酸鹽和亞硝酸鹽在食品加工過(guò)程中主要用作發(fā)色劑、防腐劑及肉制品増香劑［1］。但亞硝酸鹽具有較強(qiáng)的毒性，過(guò)量添加對(duì)人體有害［2］。同時(shí)其次生產(chǎn)物N-亞硝胺是一種致癌性很強(qiáng)的化合物［3］。因此，阻斷亞硝胺合成［4］或消除亞硝胺的前體物質(zhì)［5］是防治癌病產(chǎn)生的有效途徑之一。目前有很多清除食品中亞硝酸鹽的相關(guān)研究，最常采用的是果［6-7］、蔬品種［8］，其含有的VC、茶多酚、黃酮類(lèi)、色素和有機(jī)硫化物等物質(zhì)能有效地阻斷亞硝胺類(lèi)化合物的合成［9］。我們從文獻(xiàn)中篩選出抗壞血酸(VC)、兒茶酚、葡萄糖、牛血清白蛋白(BSA)等若干具還原性的可食性化合物，采用對(duì)氨基苯磺酸-鹽酸萘乙二胺分光光度法，考察其對(duì)亞硝酸鹽的清除能力。VC是公認(rèn)的能夠徹底清除亞硝酸鹽的物質(zhì)，它能還原亞硝酸鹽［10］;兒茶酚多數(shù)以衍生物的形式存在于自然界中［11］。水果及蔬菜中通常存在的有機(jī)酚，是植物鞣質(zhì)的成分，在體內(nèi)可氧化成醌，因此它具有極強(qiáng)的抗氧化性;BSA 結(jié)構(gòu)中包含17 個(gè)二硫鍵和一個(gè)巰基［12］，因此可與多種陽(yáng)離子，陰離子和小分子結(jié)合［13］;D-葡萄糖是自然界廣為存在的一種還原性己醛糖。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液、0.2%鹽酸萘乙二胺溶液、200μg·mL-1亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、5μg·mL-1亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液、0.2mol·L-1乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH3.6～pH5.8)、0.1mol·L-1鹽酸 均為天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司所生產(chǎn)的“南開(kāi)牌”分析純藥品。

UV-2450 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) SHIMAD-ZU，日本島津;WZ-100S 數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海一科儀器設(shè)備有限公司;電子天平XB1200C 上海精密儀器儀表有限公司;組織搗碎機(jī)DS-1 金壇市萬(wàn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠;pHS-3C 型酸度計(jì)北京華瑞博遠(yuǎn);FRESCO17 型離心機(jī) Thermo，賽默飛世爾中國(guó);恒溫干燥箱101-2 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠等。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

參照張婕莉等方法［14］，測(cè)得亞硝酸鈉最大吸收波長(zhǎng)為540nm。在此波長(zhǎng)處亞硝酸鹽濃度與吸光度值成良好的線性關(guān)系，實(shí)際測(cè)得線性回歸方程Y =0.132X +0.0092，決定系數(shù)R2=0.9976。

Y =540nm 下的吸光值;X =亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液用量

1.3 亞硝酸鹽的清除率測(cè)定

以樊明濤［15］的對(duì)氨基苯磺酸-鹽酸萘乙二胺分光光度法為準(zhǔn)，計(jì)算樣液對(duì)亞硝酸鹽的清除率公式如下:

R:清除率(%);A1:未加樣液亞硝酸鈉的吸光度;A2:加提取液后亞硝酸鈉的吸光度(已減去清除物質(zhì)的吸收度)。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，先考慮四種清除物質(zhì)的濃度，設(shè)定VC的變動(dòng)范圍為0.01%～1%;其它三種的范圍均定為0.01%～5%，與亞硝酸鹽作用60min 后，觀察清除效果。然后以各自最佳濃度為定值，變動(dòng)反應(yīng)時(shí)間，得出最適清除時(shí)間。以上反應(yīng)均是在室溫(20℃)，自然pH 條件下進(jìn)行;均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)采用4因素5 水平即U5(54)均勻表頭(表1)，在單因素得到的最適因素水平附近，共進(jìn)行5 組10 次實(shí)驗(yàn)(表2)，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)SPSS16.0(Release16.0.0(Sep，13，2007).copyright(c).SPSS-IBM.inc.，1989-2007)進(jìn)行數(shù)學(xué)分析。

表1 抗壞血酸U5(54)均勻?qū)嶒?yàn)因素水平表Table 1 The uniform deseign U5(54)of VC

表2 兒茶酚U5(54)均勻?qū)嶒?yàn)因素水平表Table 2 The uniform deseign U5(54)of catechol

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)物濃度單因素實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示(圖1、圖2)，四種反應(yīng)物濃度對(duì)亞硝酸鹽清除率均有一定的影響。隨著反應(yīng)濃度的增大，VC對(duì)亞硝酸鹽的清除率也相應(yīng)增加。當(dāng)其濃度為0.5%～1%時(shí)，清除率趨于平緩，穩(wěn)定在95%左右，濃度1%時(shí)清除率最大;兒茶酚對(duì)亞硝酸鹽的清除率隨其濃度呈線性增長(zhǎng)，達(dá)到5%時(shí)清除率最大，接近60%;葡萄糖對(duì)亞硝酸鹽的清除率成跳躍狀改變，在濃度為5%時(shí)達(dá)到峰值，為8.32%;牛血清白蛋白對(duì)亞硝酸鹽的清除率隨其反應(yīng)濃度呈S 形變化。當(dāng)反應(yīng)物濃度為0.5%時(shí)清除率達(dá)到9%，隨后出現(xiàn)下降。因此，葡萄糖和BSA 對(duì)亞硝酸鹽的清除能力均小于10%，清除效果不理想。

圖1 不同濃度VC 對(duì)亞硝酸鹽的清除作用Fig.1 Effect of the diffrent concentration of on the scavenging of nitrite

圖2 兒茶酚、葡萄糖、BSA 不同濃度對(duì)亞硝酸鹽的清除作用Fig.2 Effect of the 3 substances concentration on the scavenging of nitrite

2.2 反應(yīng)時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)

在起始階段，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這四種物質(zhì)對(duì)亞硝酸鹽的清除率均逐漸增大。VC于60min 時(shí)清除率最大，為81.94%，隨后穩(wěn)定在80%左右(圖3);兒茶酚于60min 時(shí)清除率最大，為41.59%，隨后出現(xiàn)下降;葡萄糖于120min 時(shí)清除率最大，為7.90%;但是時(shí)間對(duì)BSA 的清除率影響不大，當(dāng)60min 時(shí)其清除率達(dá)到峰值5.55%，隨后穩(wěn)定在5%左右。

對(duì)在不同反應(yīng)液濃度、反應(yīng)時(shí)間下葡萄糖、牛血清白蛋白對(duì)亞硝酸鹽的清除率在0.01 的顯著性水平下用SPSS16.0 做獨(dú)立樣本T-檢驗(yàn)(表3)?？梢钥闯?，葡萄糖和BSA 對(duì)亞硝酸鹽清除率的平均值分別為0.0578(5.78%)，0.0685(6.85%)。根據(jù)單樣本t檢驗(yàn)，設(shè)置檢驗(yàn)值為0.1(10%的清除率)時(shí)，它們的T檢驗(yàn)值的伴隨概率均都極顯著的小于0.01，即它們的清除率期望值都不到10%，因此可以認(rèn)為它們對(duì)亞硝酸鹽無(wú)顯著的清除能力。

表3 獨(dú)立樣本T-檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)表Table 3 Independent sample T-test results

圖3 四種物質(zhì)不同時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽的清除作用Fig.3 Effect of the 4 substances reaction time on the scavenging of nitrite

2.3 均勻?qū)嶒?yàn)

因?yàn)槠咸烟呛虰SA 對(duì)亞硝酸鹽無(wú)顯著的清除能力，所以以反應(yīng)液濃度(A)，反應(yīng)時(shí)間(B)，反應(yīng)pH(C)，反應(yīng)溫度(D)4 個(gè)不同因素，根據(jù)均勻?qū)嶒?yàn)要求，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)U5(54)均勻表確定VC、兒茶酚實(shí)驗(yàn)方案，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4、表5)及回歸方程(表6、表7)。

表4 VC U5(54)均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果Table 4 U5(54)uniform experiment results of VC

表5 兒茶酚U5(54)均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果Table 5 U5(54)uniform experiment results of catechol

實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)SPSS16 分析，確定均勻?qū)嶒?yàn)當(dāng)中抗壞血酸對(duì)亞硝酸鹽清除率的線性回歸方程為:Y =-0.0815-1.0470X1+0.0625X2+0.2532X3-0.0356X4，方程的決定系數(shù)R2=0.9984，方程的總體顯著性p =3.60 ×10-7，說(shuō)明此方程線性擬合很好，具有極顯著意義(表6);兒茶酚對(duì)亞硝酸鹽清除率的線性回歸方程為:Y =0.3991-0.0784X1+0.0204X2-0.0113X4，此方程R2=0.9985，p =7.49E-09，線性擬合很好，且具有極顯著意義(表7)。從以上2 個(gè)均勻?qū)嶒?yàn)線性模擬來(lái)看，X1即清除劑濃度對(duì)清除率影響極顯著，當(dāng)然濃度值有一定限度，所以其系數(shù)是負(fù)值;X2即反應(yīng)時(shí)間，它與清除率呈正相關(guān)，時(shí)間越長(zhǎng)，清除作用越徹底;X3即pH，對(duì)VC的影響極顯著，因?yàn)楫?dāng)溶液變成堿性時(shí)，VC的結(jié)構(gòu)將被破壞，只有在酸性條件下，其清除作用才最有效［16］。但pH 對(duì)兒茶酚卻沒(méi)有顯著影響;最后是X4即反應(yīng)溫度，其系數(shù)是負(fù)值，表明低溫有利于清除作用。因此，調(diào)整清除劑濃度，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，控制反應(yīng)液的pH，降低反應(yīng)溫度等條件，是提高亞硝酸鹽清除率的重要手段。通過(guò)模型計(jì)算，當(dāng)VC濃度＜0.7%，反應(yīng)時(shí)間＞15min，4 ＜pH ＜8，溫度＜4℃時(shí)，清除率＞=100%，這點(diǎn)不難從VC均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果第四項(xiàng)得到驗(yàn)證，實(shí)際清除率達(dá)到99.45;同理，對(duì)于兒茶酚，利用該線性模型預(yù)測(cè)，其濃度＜1%，反應(yīng)時(shí)間＞40min，溫度＜15℃時(shí)，清除率＞=100%。而兒茶酚均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果第2 項(xiàng)顯示實(shí)際清除率為93.38%。因此，這二種模型都是比較理想的，可以作為VC、兒茶酚清除亞硝酸鹽的數(shù)學(xué)表達(dá)。

表6 VC的回歸方程方差分析Table 6 Multiple linear regression analysis of VC

表7 兒茶酚的回歸方程方差分析Table 7 Multiple linear regression analysis of catechol

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，表明亞硝酸鹽的清除主要有兩種方式，一種是酶降解途徑，另一種是非酶降解途徑［17］。酶降解途徑可以通過(guò)細(xì)菌的亞硝酸鹽還原酶將其還原成NO，NH3。另外就是被機(jī)體的一些黃嘌呤氧化還原酶(Xanthine oxidoreductase)，亞硝酸鹽還原酶(Nitrite reductase)，NO 合成酶(NO synthase(NOS))等還原成NO［18］。而NO 可以促進(jìn)血管擴(kuò)張及血液循環(huán)，業(yè)已被證明是一種存在于動(dòng)植物中的信號(hào)分子，而且被應(yīng)用于醫(yī)療藥物中。非酶降解途徑是通過(guò)一些強(qiáng)還原性物質(zhì)如VC、黃酮類(lèi)［19］及雜環(huán)類(lèi)等物質(zhì)，將其還原成成NO，N2O，H2N2O2，N2等物質(zhì)［20］，從而降解亞硝酸鹽。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，VC、兒茶酚對(duì)亞硝酸鹽的清除效果分別達(dá)到99.45%，93.38%;理論預(yù)測(cè)它們可以徹底地清除亞硝酸鹽。因?yàn)檫@二種物質(zhì)都屬于強(qiáng)還原劑。兒茶酚是鄰苯二酚，屬于多羥基酚;而VC化學(xué)官能團(tuán)里含有-NH2，-OH及還原性羰基及酚基，所以他們可以通過(guò)非酶方式清除亞硝酸鹽，而且它們的清除作用與時(shí)間正相關(guān)，這更加說(shuō)明非酶反應(yīng)隨時(shí)間而逐步完成［21］。同時(shí)，VC、兒茶酚是大多數(shù)氧自由基的清除劑，因而能阻斷亞硝胺的合成。而葡萄糖和BSA 對(duì)亞硝酸鹽的清除率最高只有8.32%、10.93%(單因素實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的最大值，未做算數(shù)平均)，葡萄糖存在于日常飲食及機(jī)體內(nèi)，而B(niǎo)SA 類(lèi)似于人的免疫球蛋白，它們均不能還原亞硝酸鹽。因此，只有一些高還原性的生物活性物質(zhì)如黃酮類(lèi)、多糖、色素等［22］，才能有效清除亞硝酸鹽。

3.2 結(jié)論

從反應(yīng)液濃度、反應(yīng)時(shí)間等條件看來(lái)，葡萄糖、牛血清白蛋白這兩種物質(zhì)，對(duì)亞硝酸鹽的清除能力作用不明顯，均顯著低于10%。均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，抗壞血酸的濃度為0.7%、反應(yīng)時(shí)間15min、反應(yīng)pH4、反應(yīng)溫度4℃時(shí)，對(duì)亞硝酸鹽的清除率最大，達(dá)到99.45%;兒茶酚的反應(yīng)濃度為1%、反應(yīng)時(shí)間40min、反應(yīng)pH2、反應(yīng)溫度20℃時(shí)，其對(duì)亞硝酸鹽的清除率最大，達(dá)到93.38%。通過(guò)均勻?qū)嶒?yàn)得到的線性模型表明，VC、兒茶酚都可以徹底清除亞硝酸鹽。

［1］南慶賢.肉類(lèi)工業(yè)手冊(cè)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2003:205-210.

［2］Fennema O R.Food Chemistry(2nd edition)［M］.Revised and Expanded，1985:645-646.

［3］曹會(huì)蘭.亞硝酸鹽對(duì)人體的危害和預(yù)防［J］.微量元素與健康研究，2003，(2):78-80.

［4］Jakszyn P，Gonzalez C A.Nitrosamine and related food intake and gastric and oesopHageal cancer risk:A systematic review of the epidemiological evidence ［J］ . World journal of gastroenterology，2006，12(27):4296-4303.

［5］盧志強(qiáng)，婁紅祥.植物活性成分與癌癥的化學(xué)預(yù)防［J］.中草藥，2002，33(6):563-566.

［6］Jung-Hye S，Jun-Yeal L，Jong-Chan J，et al.Chemical Properties and Nitrite Scavenging Ability of Citron(Citrus junos［J］Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition，2005，34(4):496-502.

［7］艾對(duì)元，馮麗丹，齊燕姣，等.檸檬對(duì)亞硝酸鹽清除作用的研究［J］.中國(guó)食品工業(yè)，2013，(2):52-55.

［8］馮麗丹，李捷，艾對(duì)元.幾種常見(jiàn)果蔬對(duì)亞硝酸鹽清除能力的研究［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46(2):139-142.

［9］Choi S Y，Chung M J，Lee S J，et al.N-nitrosamine inhibition by strawberry，garlic，kale，and the effects of nitrite-scavenging and N - nitrosamine formation by functional compounds in strawberry and garlic［J］.Food Control，2007，18(5):485-491.

［10］薛麗，藍(lán)紅英.VC對(duì)降低香腸亞硝酸鈉殘留量的研究［J］.食品科技，2006，(6):65-66.

［11］Seung-Cheol L，So-Young K，Seok-Moon J，et al.Effect of Far- Infrared Irradiation on Catechins and Nitrite Scavenging Activity of Green Tea［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2005，54(2):399-403.

［12］Bushra H M，Munaf H Z，Ihab I A，et al.Free radical scavenging activity of silibinin in nitrite- induced hemoglobin oxidation and membrane fragility models ［J］ . Saudi pHarmaceutical Journal，2011，19(3):177-183.

［13］Pietraforte D，Salzano A M，Scorza G，et al.Scavenging of reactive nitrogen species by oxygenated hemoglobin:globin radicals and nitrotyrosines distinguish nitrite from nitric oxide reaction［J］.Free Radical Biology and Medicine，2004，37(8):1244-1255.

［14］張捷莉，丁博，劉志強(qiáng)，等.幾種肉制品中亞硝酸鹽含量的測(cè)定［J］.食品科技，2006(9):242-224.

［15］樊明濤.食品分析與檢驗(yàn)［M］.西安:世界圖書(shū)出版西安公司，1998.204-207.

［16］Takahama U，Hirota S，Kawagishi S.Effects of pH on nitriteinduced formation of reactive nitrogen oxide species and their scavenging by pHenolic antioxidants in human oral cavity［J］.Free Radical Research，2009，43(3):250-261.

［17］Ivanov V M.The 125th Anniversary of the Griess Reagent［J］.Journal of Analytical Chemistry，2004，59(10):1002-1005.

［18］Kazuyasu S，Kazuki K，Hitoshi A，et al.Luteolin:A Strong Antimutagen against Dietary Carcinogen，Trp-p-2 in Peppermint，Sage，and Thyme［J］.J Agric Food Chem，1995，43(2):410-414

［19］Jun L，Songyi L，Zuozhao W. et al. Supercritical fluid extraction of flavonoids from Maydis stigma and its nitrite -scavenging ability［J］.Food and Bioproducts Processing，2011，89(4):333-339.

［20］Feelisch M，F(xiàn)ernandez B，Bryan N，et al.Tissue processing of nitrite in hypoxia:an intricate interplay of nitric oxide-generating and-scavenging systems［J］.Journal of Biological Chemistry，2008，283(49):33927-33934.

［21］Jae S C，Si H P，Jin-Ho C.Nitrite scavenging effect by flavonoids and its structure-effect relationship［J］Archives of pharmacal Research，1989，12(1):26-33.

［22］Jin-Hyun K，Ki-Moon P.Nitrite scavenging and superoxide dismutase-like activities of herbs，spices and curries［J］.Korean journal of food science and technology，2000，32(3):706-712.