不同方式凍結(jié)后養(yǎng)殖大黃魚肌肉理化特性在凍藏期間的變化

劉永固，婁永江，屠冰心，李流川

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211）

近年來(lái)，隨著育種技術(shù)的突破和網(wǎng)箱養(yǎng)殖技術(shù)的推廣，大黃魚產(chǎn)量不斷上升，除一部分鮮銷外，冷凍保藏是最主要的加工銷售途徑。但是由于生成大的冰晶，常規(guī)冷凍后的凍品在貯藏和解凍后品質(zhì)下降比較嚴(yán)重。食品高壓轉(zhuǎn)換冷凍（high pressure shift freezing，簡(jiǎn)稱PSF）是三大高壓冷凍技術(shù)之一，它主要利用水的不同冰晶形態(tài)，獲得不同的晶型，降低或者避免冰晶對(duì)食品組織的機(jī)械損傷[1]。1990年前后日本京都大學(xué)林力丸教授首先在冷凍過(guò)程中引入溫度和壓力這兩個(gè)參數(shù)，不僅實(shí)現(xiàn)了快速凍結(jié)，而且有效地提高了凍品的質(zhì)量。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)不同冷凍食品的PSF冰晶形成機(jī)理及其應(yīng)用作了大量研究，如豆腐、豬肉、凝膠、土豆[2-5]。研究表明與傳統(tǒng)冷凍（conventional air freezing，簡(jiǎn)稱CAF）相比，PSF能更好的保留食品的微觀結(jié)構(gòu)，同時(shí)還能改善食品品質(zhì)。但是，到目前為止仍未出現(xiàn)高壓轉(zhuǎn)換冷凍技術(shù)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的報(bào)道。本文以整條養(yǎng)殖大黃魚為對(duì)象，主要研究三種不同方式冷凍后大黃魚肌肉理化特性在凍藏期間的變化，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)超高壓保鮮提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃魚（Pseudosciaena croceas） 取自浙江某養(yǎng)殖場(chǎng)，一級(jí)鮮度，體長(zhǎng)（24.3±1.60）cm，鮮重（332.63±15.23）g。洗凈，瀝干表面水分，真空包裝后置于4℃冰箱中備用；Tris（三羥甲基氨基甲烷） 分析純，阿拉丁試劑有限公司；牛血清蛋白 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酒石酸鉀鈉 分析純，天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；二甲苯 分析純，江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司；中性樹(shù)脂、蘇木精 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HPP.M1-600/5超高壓處理設(shè)備 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；PL403電子分析天平 梅特-托利多儀器（上海）有限公司；H2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HM505E冰凍切片機(jī) 德國(guó)；OLYMPUS BX51正置熒光萬(wàn)能顯微鏡 日本；DeltaTRAK電子溫度記錄儀 美國(guó)；TA-XTplus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro System公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 凍結(jié)方法 CAF法冷凍：將真空包裝好的大黃魚置于-25℃環(huán)境中凍結(jié)，待中心溫度至-20℃時(shí)立即取出放入-20℃冷庫(kù)中凍藏。

PSF法冷凍：以無(wú)水乙醇與水的混合溶液（1∶1配制）注入高壓腔內(nèi)，當(dāng)溫度分別下降到-14℃（145MPa）、-18℃（205MPa）時(shí)，把真空包裝好的大黃魚放入介質(zhì)中。然后以4MPa/s的速率分別升壓至145、205MPa，分別保壓30、75min后在10s內(nèi)迅速卸壓，卸壓結(jié)束，立即從腔體內(nèi)取出浸入-20℃循環(huán)冷卻液中，待魚體中心溫度至-20℃時(shí)，移入-20℃冷庫(kù)中凍藏。

1.2.2 組織切片的制作與觀察 以1.2.1凍結(jié)的魚體為樣本，在魚體中線以上靠近頭部位置按纖維走向取1cm×1cm×1.5cm的肌肉樣（鮮魚采用液氮凍結(jié)），按劉世新[6]冰凍切片法，將樣品切成厚度為15μm的薄片后，用改良Van-Gieson法（VG法）染色，再用中性樹(shù)脂封片，置于OLYMPUS BX51顯微鏡上觀察拍照。整個(gè)操作過(guò)程在-20℃環(huán)境中進(jìn)行。

1.2.3 鹽溶性蛋白含量的測(cè)定 取凍藏樣品若干，流動(dòng)水解凍，去包裝袋后取魚中線以上背部肌肉（n=3～5），參照萬(wàn)建榮[7]的方法提取鹽溶性蛋白，并按雙縮脲法測(cè)定蛋白含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of protein content

1.2.4 質(zhì)構(gòu)分析（Texture profile analysis，TPA） 取凍藏樣品若干，流動(dòng)水解凍，去包裝袋后取魚中線以上靠近頭部的肌肉樣，去皮，切成1.5cm×1.5cm×1cm小塊。測(cè)定時(shí)質(zhì)構(gòu)儀探頭型號(hào)選擇P/50，測(cè)試前速度2mm/s；測(cè)試速度1mm/s；測(cè)試后速度1mm/s；壓縮比60%；停留間隔時(shí)間5s；觸發(fā)類型自動(dòng)；觸發(fā)力10g；數(shù)據(jù)采集速率200。測(cè)前將樣品置于4℃冰箱1h，每組樣品測(cè)定6次。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Excel和SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌肉組織顯微結(jié)構(gòu)的變化

圖2從橫截面和縱截面兩方面顯示了養(yǎng)殖大黃魚肌肉組織的顯微結(jié)構(gòu)，新鮮大黃魚樣品的橫截面呈較完整和規(guī)則的圓形或多邊形，縱截面中纖維間連接緊密，排列整齊，其原生質(zhì)分布均勻。大黃魚經(jīng)三種不同方式凍結(jié)后，樣品產(chǎn)生的冰晶大小及分布差異很大，組織結(jié)構(gòu)均受到不同程度的破壞。CAF法冷凍后的樣品肌肉組織內(nèi)產(chǎn)生的冰晶大而少，且難以判斷冰晶產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外（見(jiàn)圖3（a））。145MPa、-14℃冷凍后的樣品組織內(nèi)產(chǎn)生的胞內(nèi)冰晶小而多，分布均勻，肌纖維破壞程度?。ㄒ?jiàn)圖3（b））。205MPa、-18℃冷凍后樣品產(chǎn)生的冰晶更細(xì)，冰晶對(duì)肌纖維的破壞程度更小，肌纖維形狀變化較大（見(jiàn)圖3（c））。其原因在于CAF是一個(gè)相對(duì)緩慢的凍結(jié)過(guò)程，最大冰晶生成帶時(shí)間較長(zhǎng)，形成的冰晶體大。而在PSF中，壓力快速解除時(shí)，魚體內(nèi)處于過(guò)冷態(tài)的自由水瞬間產(chǎn)生大量細(xì)小的冰晶。且研究表明，過(guò)冷度每超過(guò)1℃，冰晶核的形成速率將會(huì)增加10倍[8]。但是205MPa凍結(jié)時(shí)由于壓力較高，處理時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致穩(wěn)定蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵（氫鍵、離子鍵、疏水相互作用等）遭到破壞，肌原纖維發(fā)生聚合。從常規(guī)冷凍樣品肌肉縱截面的顯微照片中仍然可以看到大的冰晶體留下的空洞（見(jiàn)圖4（a）），而高壓冷凍樣品的肌纖維發(fā)生了輕微的斷裂或者擠壓，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)冰晶（見(jiàn)圖4（b、c））。3個(gè)月后PSF法冷凍的樣品在微觀結(jié)構(gòu)上均沒(méi)有明顯改變。圖5（b）與圖3（b）相比，肌纖維內(nèi)的冰晶體略有增大，肌纖維裂開(kāi)。這是因?yàn)樵趦霾剡^(guò)程中相互接觸的細(xì)小冰晶聚集在一起，或者溫度變動(dòng)產(chǎn)生重結(jié)晶。圖6（b）或圖4（b）中肌纖維出現(xiàn)裂口也說(shuō)明了這一點(diǎn)。而CAF凍結(jié)樣品肌肉橫截面呈片狀，破損嚴(yán)重。因此，PSF可以大大減小冰晶體的尺寸，避免冰晶對(duì)魚體肌肉組織造成嚴(yán)重的機(jī)械損傷，從而有利于提高凍品的品質(zhì)。

圖2 鮮魚樣品肌肉的顯微照片（100×）Fig.2 Micrographs of unfrozen sample（100×）

圖3 冷凍樣品凍藏0d時(shí)，樣品肌肉的橫切顯微照片（100×）Fig.3 Crosscut micrographs of frozen sample muscle during the frozen storage for 0d（100×）

圖4 冷凍樣品凍藏0d時(shí)，樣品肌肉的縱切顯微照片（100×）Fig.4 Slitting line micrographs of frozen sample muscle during the frozen storage for 0d（100×）

圖5 冷凍樣品凍藏90d時(shí)，樣品肌肉的橫切顯微照片（100×）Fig.5 Crosscut micrographs of frozen sample muscle during the frozen storage for 90d（100×）

圖6 冷凍樣品凍藏90d時(shí)，樣品肌肉的縱切顯微照片（100×）Fig.6 Slitting line micrographs of frozen sample muscle during the frozen storage for 90d（100×）

2.2 鹽溶性蛋白含量的變化

圖7 鹽溶性蛋白含量在凍藏期間的變化Fig.7 Changes of the salt extractable protein content during the frozen storage

大黃魚肌肉在凍藏期間鹽溶性蛋白含量的變化如圖7所示。凍藏初期，PSF凍結(jié)樣品的鹽溶性蛋白含量分別為38.50mg/g（145PMa）、24.69mg/g（205MPa），均小于CAF凍結(jié)樣品的98.65mg/g。這是因?yàn)閴毫^高或者處理時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)的三級(jí)或者四級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆改變，引起蛋白質(zhì)變性，且壓力越大，保壓時(shí)間越長(zhǎng)，變性程度越大。CAF法凍結(jié)樣品凍藏2個(gè)月和3個(gè)月后，鹽溶性蛋白含量均顯著減少（p＜0.05）。凍藏結(jié)束以后，鹽溶性蛋白含量從98.65mg/g下降到74.06mg/g，下降幅度為24.93%。一般認(rèn)為這是由于在凍藏過(guò)程中蛋白質(zhì)的部分結(jié)合水形成冰晶，導(dǎo)致蛋白分子中的側(cè)鏈和側(cè)鏈之間互相結(jié)合，形成超大分子的不溶性凝集體，引起蛋白質(zhì)的不可逆變性。145MPa、-14℃和205MPa、-18℃冷凍后的樣品在凍藏期間鹽溶性蛋白含量均沒(méi)有顯著變化（p＞0.05），但是后者在凍藏3個(gè)月后有所增加，這與Valeria等[9]對(duì)黑鱸的研究結(jié)論相似。

2.3 質(zhì)構(gòu)特性的變化

圖8 質(zhì)構(gòu)特性在凍藏期間的變化Fig.8 Changes of texture during the frozen storage

質(zhì)構(gòu)是評(píng)價(jià)魚類等水產(chǎn)品肌肉品質(zhì)的一個(gè)非常重要的指標(biāo)，同時(shí)也是消費(fèi)者評(píng)價(jià)肉類質(zhì)量?jī)?yōu)劣的主要依據(jù)[10]。由圖8可知，在凍藏期間，三種方式凍結(jié)的大黃魚肌肉的硬度、彈性和咀嚼性均逐漸下降，不過(guò)較之CAF，PSF（205MPa）冷凍的樣品彈性（b）和咀嚼性（c）均顯著提高（p＜0.05），凍藏初期分別提高13.73%、26.75%，90d后分別提高18.66%、31.20%。這主要因?yàn)楦邏阂鸬鞍踪|(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。研究表明，高壓能夠促使肌球蛋白變形，還可以抑制肌肉組織中的水解蛋白酶活性，繼而影響魚體肌肉的質(zhì)構(gòu)特性[11]。此外，PSF冷凍過(guò)程中產(chǎn)生細(xì)小的冰晶也有利于較小損傷。從圖8中可以看出，凍藏初期145MPa、-14℃冷凍樣品的硬度與新鮮樣品相比沒(méi)有顯著變化（p＞0.05），90d后略高于CAF冷凍的樣品，而205MPa、-14℃冷凍的樣品的硬度顯著提高（p＜0.05），90d后，硬度仍然比新鮮樣品高。這可能與壓力及時(shí)間有關(guān)。雒莎莎等[12]發(fā)現(xiàn)超高壓（450MPa、15min、15℃）處理后鳙魚肌原纖維的肌節(jié)被徹底破壞，蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)，形成了堅(jiān)實(shí)的凝膠網(wǎng)絡(luò)，硬度、彈性和咀嚼性顯著上升，而當(dāng)壓力＜150MPa時(shí)并沒(méi)有顯著提高肌肉的硬度。同一階段，145MPa、-14℃冷凍后的大黃魚肌肉的硬度、彈性及咀嚼性與新鮮樣品最為接近。

3 討論

本文采用三種不同方法冷凍養(yǎng)殖大黃魚，然后研究了魚體肌肉在凍藏期間理化特性的變化。結(jié)果表明：PSF凍結(jié)過(guò)程中產(chǎn)生了大量細(xì)小的冰晶，它們均布于凍品組織中，相比之下，205MPa、-18℃條件下凍結(jié)產(chǎn)生的冰晶更加細(xì)小。另外在凍藏期間PSF凍結(jié)樣品的肌肉顯微結(jié)構(gòu)及鹽溶性蛋白含量均無(wú)顯著變化（p＞0.05），而CAF凍結(jié)樣品在凍藏期間改變顯著（p＜0.05），凍藏結(jié)束以后，鹽溶性蛋白含量從98.65mg/g下降到74.06mg/g，下降幅度為24.93%。與CAF相比，PSF法冷凍的樣品肌肉彈性和咀嚼性均顯著提高（p＜0.05）。同一階段，145MPa、-14℃冷凍后的大黃魚肌肉的硬度、彈性及咀嚼性與新鮮樣品最為接近。

另外，由于超高壓作用能殺滅食品中的多種微生物，延長(zhǎng)生鮮食品的保質(zhì)期。同時(shí)超高壓處理是一個(gè)物理過(guò)程，對(duì)維生素、色素和風(fēng)味物質(zhì)等低分子化合物的共價(jià)鍵無(wú)明顯影響，能夠保持原有的新鮮味道和營(yíng)養(yǎng)成分。然而，壓力達(dá)到200MPa后容易引起蛋白質(zhì)的不可逆變性，導(dǎo)致肉組織的外觀發(fā)生變化，這在一定程度上削減了超高壓在食品冷凍冷藏中的優(yōu)勢(shì)。比較而言，145MPa、-14℃條件下凍結(jié)更有利于提高養(yǎng)殖大黃魚凍品品質(zhì)。

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