重組藻紅藍(lán)蛋白α亞基的穩(wěn)定性研究

王 娟，蘇海璐，陳秀麗，蘇 平，涂俊銘

（湖北師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃石435002）

藻膽蛋白（包括藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白和藻紅藍(lán)蛋白）是某些藻類重要的捕光蛋白，用途極為廣泛[1]。由于其具有無毒性、水溶性、高熒光、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)既可以作為天然色素廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、染料等工業(yè)，又可以制成熒光試劑，用于臨床醫(yī)學(xué)診斷和免疫化學(xué)及生物工程等研究領(lǐng)域中[2]。藻膽蛋白目前還是從藻類直接提取，生產(chǎn)成本很高，因此限制了其廣泛的應(yīng)用[3]。我們希望通過分子生物學(xué)的方法，將相關(guān)的基因重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，以實(shí)現(xiàn)藻膽蛋白的生物合成。研究表明[4-5]，通過體外表達(dá)層理鞭枝藻（Mastigocladus laminosus）中藻紅藍(lán)蛋白操縱子中E與F基因編碼的產(chǎn)物PecE、PecF和藻紅藍(lán)蛋白（PEC）α亞基的脫輔基蛋白，在一定的重組體系里獲得了具有可逆光致變色特性的α-PEC。本工作就是利用該項(xiàng)技術(shù)成果，獲得目的蛋白。迄今為止，對(duì)于藻紅藍(lán)蛋白生物合成理論研究已相當(dāng)成熟，但對(duì)于它的穩(wěn)定性影響和應(yīng)用研究很少有報(bào)道，而藻藍(lán)蛋白方面已有人從事該項(xiàng)工作[6-9]。藻紅藍(lán)蛋白很重要的一個(gè)應(yīng)用就是利用其鮮艷的紅色熒光性質(zhì)充當(dāng)食品和化妝品天然色素，而且因?yàn)槠鋪碜杂诤Ｑ笤孱愔参?，安全性高，且具有生理活性，兼有營養(yǎng)、保健等功能[10]，所以更易被消費(fèi)者接受。一般對(duì)食品天然色素穩(wěn)定性的檢驗(yàn)主要考慮pH、光照、溫度、金屬離子、抗氧化劑、碳水化合物等因素的影響[11-14]。本文主要從上述六個(gè)方面進(jìn)行了藻紅藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的相關(guān)研究，為其在未來應(yīng)用上奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白α亞基的工程菌（含有pecE/pecF、pecA、PCB合成酶的三質(zhì)粒大腸桿菌菌株） 實(shí)驗(yàn)室保存；蛋白胨，酵母粉，IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷），Amp（氨芐青霉素），Kan（卡那霉素），Chl（氯霉素）。

4300 pro 型紫外可見光譜儀 美國Amsean Ultrospec；F-4500型熒光光譜儀 日本日立公司；飛鴿系列TGL-18G-C型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭公司；JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝科儀研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻紅藍(lán)蛋白α亞基的制備和提純[15]挑取目的單菌落接種于5mL（氯霉素17μg/mL、氨芐霉素25μg/mL、卡那霉素15μg/mL）的LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取1mL飽和培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100mL含有對(duì)應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期（OD600約0.6），將培養(yǎng)物靜置于20℃冰水浴中1h。然后加入IPTG至終濃度為1mmol/L，20℃誘導(dǎo)表達(dá)9～12h。離心收集菌體-20℃保存?zhèn)溆?。將凍存的?xì)胞重懸于柱平衡液（0.5mol/L NaCl，20mmol/L KPB，pH 7.2）中，超聲10min后，離心5000r/min 5min后，分別得到上清液和沉淀。上清液直接用已預(yù)平衡的鎳螯合親合層析柱進(jìn)行純化。上樣后，先用3倍柱床體積的柱平衡液和3倍柱床體積含有50mmol/L咪唑的柱平衡液洗柱，去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)或雜質(zhì)，再用合適體積洗脫液（500mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，20mmol/L KPB，pH7.2）進(jìn)行洗脫收集樣品。收集液中的蛋白質(zhì)濃度通過Bradford法測定。將收集液于4℃的透析液（0.5mol/L NaCl，50mmol/L KPB，pH7.2）透析后，置于4℃避光保存，繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Bradford法測定蛋白質(zhì)的濃度

1.2.2.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 在1.5mL離心管中，加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液0～10μL，加入950μL Bradford工作液并混合均勻，補(bǔ)加平衡液使終體積為1mL，室溫放置5min后測A595nm吸收值，測三次，計(jì)算每個(gè)樣品的平均吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定曲線的線性范圍。

1.2.2.2 測定藻紅藍(lán)蛋白的濃度 在同樣的條件下，測定樣品的平均吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的濃度，并以該蛋白溶液為儲(chǔ)存原液。

1.2.3 溫度對(duì)藻紅藍(lán)蛋白穩(wěn)定性影響 避光條件下，將提純好的蛋白分別置于0、4、20、37、55、72、98℃等水浴中，隔一定時(shí)間分別測定其熒光強(qiáng)度。

1.2.4 pH對(duì)藻紅藍(lán)蛋白穩(wěn)定性影響 配制pH為2.0、4.0、5.0、6.0、7.2、8.0、9.0、10.0、11.0、13.0等緩沖溶液，分別加入同等濃度的蛋白，測定其熒光強(qiáng)度。

1.2.5 紫外照射對(duì)藻紅藍(lán)蛋白穩(wěn)定性影響 將5%、10%蛋白原液置于紫外線照射，每隔20min測一次熒光和紫外，觀察其變化。

1.2.6 鹽濃度對(duì)藻紅藍(lán)蛋白穩(wěn)定性影響 取10%蛋白原液1mL加入等體積的5mol/L NaCl溶液，并測定紫外圖譜。

1.2.7 碳水化合物對(duì)藻紅藍(lán)蛋白穩(wěn)定性影響 分別配制1%蔗糖、葡萄糖、乳糖、0.1%淀粉的水溶液，按照1∶1比例加入到10%蛋白原液里，測定熒光圖譜。

1.2.8 金屬離子對(duì)藻紅藍(lán)蛋白穩(wěn)定的影響 配制較高濃度Ca2+、Fe2+、Mn2+、Al3+、Cu2+、Pb2+、Zn2+等離子溶液，按照表1離子濃度加到蛋白原液里。測定其熒光強(qiáng)度的改變。

1.2.9 小分子對(duì)藻紅藍(lán)蛋白穩(wěn)定的影響 配制較高濃度的抗壞血酸（VC）、尿素、巰基乙醇等溶液，按照1∶1比例加入到10%蛋白原液里。測定其熒光強(qiáng)度的改變。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)濃度的測定

根據(jù)Bradford 法，獲得的色素蛋白濃度是0.43mg/mL，下面的實(shí)驗(yàn)根據(jù)需要進(jìn)行稀釋不同的倍數(shù)。

2.2 溫度對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響

避光條件下，將色素蛋白溶液分別置于以下設(shè)定溫度的水浴中，間隔一定時(shí)間測定蛋白熒光。發(fā)現(xiàn)0、4、20℃時(shí)蛋白的熒光強(qiáng)度幾乎沒有多少改變，說明該蛋白在低溫條件下很穩(wěn)定。在72、98℃下，水浴5min，大量蛋白發(fā)生聚集，發(fā)現(xiàn)其熒光強(qiáng)度已經(jīng)大大下降，可見高溫對(duì)蛋白有劇烈的破壞作用。避光條件下12.5h過后，4、20、37、55℃下色素蛋白熒光強(qiáng)度依次遞減。如圖1所示，色素蛋白熒光隨著時(shí)間的延長，均是下降趨勢；溫度越高，色素蛋白受到的影響越大。

圖1 溫度對(duì)色素蛋白穩(wěn)定性影響Fig.1 Effect of different temperature on the stability of protein

2.3 pH對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響

將色素蛋白原液稀釋10倍，分別測pH 2～13溶液下色素蛋白的最高強(qiáng)度熒光，得到圖2。從圖2可以看出，蛋白在pH為7.2環(huán)境下熒光強(qiáng)度是最高的，在pH4.0～9.0范圍內(nèi)，熒光改變不大，而在pH小于3或大于10的情況下，熒光大大下降，只有初始的15%左右，穩(wěn)定性被破壞。說明了該色素蛋白在過酸或過堿的情況下不能穩(wěn)定存在，這與蛋白在中性條件下最穩(wěn)定存在符合，因此選用的平衡液都是pH=7.2的緩沖液。

圖2 緩沖液pH對(duì)色素蛋白穩(wěn)定性影響Fig.2 Effect of different pH on the stability of protein

2.4 紫外照射對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響

選用5%、10%兩種濃度的蛋白，經(jīng)過紫外線長時(shí)間照射，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度不僅明顯改變，熒光發(fā)射圖譜也發(fā)生很大的變化。圖3是紫外照射下間隔20min測蛋白最高熒光強(qiáng)度，隨著照射時(shí)間增加，蛋白熒光強(qiáng)度逐漸變??；圖4是蛋白經(jīng)過100min照射后的熒光掃描譜圖，可以看到已經(jīng)沒有明顯的發(fā)射峰了。說明紫外線照射對(duì)蛋白穩(wěn)定性影響很大，已使蛋白變性，可能是紫外照射使蛋白分子上的電子發(fā)生躍遷所致。這提示我們蛋白不宜放在任何有強(qiáng)紫外照射的地方。同時(shí)也做了光照與避光對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，避光能讓蛋白穩(wěn)定的時(shí)間更長久。

圖3 紫外照射對(duì)色素蛋白穩(wěn)定性影響Fig.3 Effect of Ultra-Violet on the stability of protein

圖4 蛋白經(jīng)紫外照射后的熒光掃描光譜Fig.4 Fluorescence spectra of protein irradiated by ultraviolet

2.5 離子濃度對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響

這里離子濃度僅指考察NaCl濃度。由于蛋白在溶液中較穩(wěn)定存在，選用高濃度蛋白溶液，用NaCl溶液進(jìn)行稀釋不同倍數(shù)，在不同濃度NaCl下測紫外波長510nm的吸光度得到圖5，測定不同濃度NaCl溶液下蛋白的紫外吸收掃描圖譜得到圖6。結(jié)果表明，蛋白溶液經(jīng)過NaCl溶液的稀釋，其紫外吸收峰位置和峰形并沒有發(fā)生變化（圖6）；吸光度發(fā)生了變化，這是因?yàn)榈鞍兹芤航?jīng)過稀釋所致，從吸光強(qiáng)度A呈線性變化可以看出（圖5）。說明NaCl溶液即離子濃度對(duì)蛋白穩(wěn)定性沒有很大的影響。

圖5 NaCl離子濃度對(duì)蛋白穩(wěn)定性影響Fig.5 Effect of ion concentration on the stability of protein

圖6 不同離子濃度下蛋白的紫外吸收光譜Fig.6 Ultraviolet absorption spectra of protein on different ion concentration

2.6 糖類物質(zhì)對(duì)蛋白穩(wěn)定性影響

實(shí)驗(yàn)選取了蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉等糖類物質(zhì)，加入到蛋白溶液里，間隔一定時(shí)間測蛋白最高熒光強(qiáng)度做圖得到圖7。從圖7可以看出，同一濃度下，蔗糖對(duì)蛋白熒光猝滅的影響最小，熒光強(qiáng)度也最高，色素蛋白穩(wěn)定性也較好。

圖7 糖類物質(zhì)對(duì)蛋白穩(wěn)定性影響Fig.7 Effect of Carbohydrate on the stability of protein

2.7 金屬離子對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響

實(shí)驗(yàn)選用Ca2+、Fe2+、Mn2+、Al3+等高濃離子溶液，按圖8鈣離子濃度所示，加一定量高濃離子溶液到蛋白溶液稀釋，掃描熒光圖譜，并由離子濃度對(duì)最高熒光強(qiáng)度做直線圖。以Ca2+為例（如圖8顯示），隨著Ca2+濃度不斷增加，熒光強(qiáng)度逐漸下降。初步認(rèn)為金屬離子與蛋白發(fā)生結(jié)合效應(yīng)，或是金屬離子使蛋白變性，改變了蛋白空間結(jié)構(gòu)，因而影響其發(fā)射熒光的強(qiáng)度。

圖8 Ca2+濃度對(duì)蛋白穩(wěn)定性影響Fig.8 Effect of Ca2+concertration on the stability of protein

表1 金屬離子對(duì)色素蛋白的影響Table 1 Effect of different metal ion on the stability of protein

同樣的方法，測定了其他金屬離子對(duì)蛋白的熒光影響，當(dāng)離子濃度達(dá)到一定時(shí)熒光下降百分比得到表1數(shù)據(jù)。根據(jù)表1所示，對(duì)蛋白影響最大的是Cu2+，當(dāng)離子濃度僅為4mmol/L時(shí)，熒光下降了89.2%，影響最小的是Ca2+，當(dāng)離子濃度達(dá)到了0.67mol/L時(shí)，熒光下降了30.6%。實(shí)驗(yàn)還考察了Na+、K+、NH4+等，發(fā)現(xiàn)對(duì)其影響很小，故不在表中列出來。

2.8 小分子對(duì)蛋白穩(wěn)定性影響

分別考察了尿素（NH2NH2）、抗壞血酸（VC）、巰基乙醇（ME）對(duì)蛋白紫外吸收圖譜的影響。從圖9可以看到，經(jīng)過24h后這些小分子不同程度上使蛋白的紫外吸收圖譜發(fā)生改變，程度最為劇烈的是巰基乙醇，其次是尿素和抗壞血酸。巰基乙醇的作用使蛋白發(fā)生了嚴(yán)重的藍(lán)移現(xiàn)象，而尿素則使兩個(gè)吸收峰的強(qiáng)度發(fā)生改變，抗壞血酸有弱小的影響。巰基乙醇可以打開蛋白質(zhì)的二硫鍵，對(duì)蛋白原來空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的改變，造成了紫外吸收圖譜藍(lán)移現(xiàn)象。而尿素能破壞蛋白中的氫鍵，一定程度上影響了色素的吸收，所以有吸收比例的改變?？箟难釋?duì)蛋白穩(wěn)定的影響較小，此外檸檬酸鈉、苯甲酸鈉等也幾乎沒有變化，可以進(jìn)一步加以應(yīng)用。而較強(qiáng)氧化性的H2O2分子則使蛋白明顯變性，說明該蛋白有較弱的還原性，置于空氣中很容易被氧化。

圖9 小分子對(duì)蛋白穩(wěn)定性影響Fig.9 Effect of different small molecules on the stability of protein

3 結(jié)論

本文利用生物技術(shù)方法表達(dá)出了具有紅色熒光的藻紅藍(lán)蛋白a亞基，探討了溫度、pH、離子濃度、光照等因素影響，也考察了常見金屬離子、小分子對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響。其中溫度對(duì)蛋白影響最大，超過55℃蛋白易變性；其次紫外光照也有很大影響；pH小于3或大于11蛋白不穩(wěn)定，離子濃度影響不大。而大多數(shù)重金屬離子都會(huì)使蛋白發(fā)生聚集下沉，熒光猝滅；鉀鈉離子沒有影響；尿素、巰基乙醇、H2O2分子都影響色素蛋白存在，而抗壞血酸、檸檬酸鈉、苯甲酸鈉影響不大，可以當(dāng)作添加劑。這些都為該色素蛋白今后實(shí)際應(yīng)用打下必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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