卵巢上皮性腫瘤中Ezrin、E-cadherin及EGFR的表達(dá)及臨床意義

冼麗英，尹有群，趙東暉，趙繼紅，葉偉標(biāo)

(東莞市人民醫(yī)院病理科，廣東東莞523000)

·論著·

卵巢上皮性腫瘤中Ezrin、E-cadherin及EGFR的表達(dá)及臨床意義

冼麗英，尹有群，趙東暉，趙繼紅，葉偉標(biāo)

(東莞市人民醫(yī)院病理科，廣東東莞523000)

目的探討卵巢上皮性腫瘤中Ezrin、E-cadherin和EGFR的表達(dá)意義及其與預(yù)后的關(guān)系。方法選取有隨訪資料的卵巢上皮性腫瘤(包括卵巢癌77例和11例良性、9例交界性卵巢上皮性腫瘤)，并隨機(jī)選取正常卵巢組織7例，應(yīng)用用免疫組化SP法檢測Ezrin、E-cadherin和EGFR的表達(dá)。結(jié)果Ezrin和E-cadherin在正常卵巢組織、良性、交界卵巢上皮腫瘤組織及卵巢癌組織中的表達(dá)陽性率呈遞減趨勢，并與卵巢癌FIGO分期、組織學(xué)分級呈負(fù)相關(guān)。而EGFR表達(dá)的呈上升趨勢，其表達(dá)與卵巢癌FIGO分期及腹腔種植呈正相關(guān)。單因素分析顯示Ezrin和E-cadherin陰性表達(dá)患者的累積生存率明顯縮短，而EGFR陰性表達(dá)患者累積生存率高。多因素COX回歸模型顯示：Ezrin、E-cadherin的陰性及EGFR的陽性表達(dá)是卵巢癌患者生存獨立危險因素。相關(guān)分析顯示，Ezrin與E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)，與EGFR呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論Ezrin與卵巢癌的浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是卵巢癌不良預(yù)后因素，并協(xié)同調(diào)節(jié)E-cadherin和EGFR而影響卵巢癌細(xì)胞的粘附和轉(zhuǎn)移性。

Ezrin；E-cadherin；EGFR；卵巢癌

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中的主要致死原因，早期一般非常隱匿，發(fā)展迅速，極易出現(xiàn)盆腹腔播散和腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。埃茲蛋白(Ezrin)是一種細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架之間的連接蛋白，近年的研究發(fā)現(xiàn)它與腫瘤關(guān)系密切，被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[1]。體外試驗證明：許多生長因子(如EGF、HGF)能夠引發(fā)埃茲蛋白分子的C端氨基酸磷酸化。E-cadherin是介導(dǎo)同質(zhì)細(xì)胞間連接的粘附蛋白，主要分布于上皮組織中。當(dāng)E-cadherin表達(dá)異常時，細(xì)胞間粘附能力下降，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。EGFR是由C-erbB.1基因編碼的跨膜受體，在多種人類惡性腫瘤中高表達(dá)，當(dāng)特異性配體如表皮生長因子(EGF)或其相關(guān)蛋白與EGFR結(jié)合，就能夠通過相應(yīng)酪氨酸激酶的自身磷酸化作用而激活受體，從而激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)連鎖反應(yīng)。目前，聯(lián)合檢測卵巢上皮性腫瘤中Ezrin、E-cadherin和EGFR表達(dá)的研究較少。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測了有隨訪資料的卵巢上皮性腫瘤，以探討其對卵巢癌浸潤、轉(zhuǎn)移的作用以及對預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本和試劑收集1993年1月至2005年5月有隨訪資料的卵巢癌77例，其中漿液性腺癌59例，黏液性腺癌16例，子宮內(nèi)膜樣腺癌2例。同時收集11例良性、9例交界性卵巢上皮性腫瘤，并隨機(jī)選取同期對側(cè)正常卵巢切除標(biāo)本7例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%的中性福爾馬林液中固定，石蠟包埋，常規(guī)HE染色。所有HE切片均在光鏡下觀察進(jìn)行病理診斷及分類。卵巢癌病例按照FIGO臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。組織學(xué)分級按WHO分級標(biāo)準(zhǔn)。所有病例均獲隨訪，隨訪時間為0～136個月，中位隨訪時間為46個月。卵巢腫瘤患者的病理資料完整，術(shù)前均未化療或放療。

1.2 方法(1)制作組織芯片：選擇組織切片中具有代表性的兩個組織區(qū)域，用特制的取樣針從已定位的蠟塊上鉆取圓柱形組織，轉(zhuǎn)移到已鉆好孔的空白蠟塊上，排列成整齊的陣列，連續(xù)4 μm切片，裱于硅化玻片上備用。(2)免疫組化SP法：應(yīng)用免疫組化SP法檢測卵巢癌組織、良性卵巢上皮腫瘤組織和正常卵巢組織中Ezrin、E-cadherin與EGFR的表達(dá)。Ezrin單抗購于福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；EGFR、E-cadherin單抗購于北京中杉生物技術(shù)開發(fā)公司；SP即用型試劑盒購于北京中杉生物技術(shù)開發(fā)公司。用已知的Ezrin、E-cadherin與EGFR陽性切片為陽性對照，用磷酸鹽緩沖溶液代替一抗做陰性對照。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。

1.3 免疫組化結(jié)果判定Ezrin、E-cadherin與 EGFR免疫組化判定均采用綜合陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度和所占百分比判斷[2]。按染色強(qiáng)度評分：無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別為0、1、2和3分。按陽性細(xì)胞所占百分比:陰性為0分，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分，兩者乘積得RS評分，-(0，1)；+(2，4)；++(6，8)；+++(9，12)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法免疫組化陽性率兩兩比較用Mann-Whitney U秩和檢驗、多組之間用Kruskal-Wallis Test分析，臨床病理特征等級資料相關(guān)性研究采用kendall's tau-b相關(guān)分析；卵巢癌患者生存分析采用Kaplan-Meier法、單因素及多因素Cox生存回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 Ezrin、E-cadherin和EGFR在卵巢組織中的表達(dá)Ezrin、E-cadherin和EGFR均表達(dá)于卵巢腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒。Ezrin呈極性分布，主要定位于胞膜，而在卵巢癌細(xì)胞中呈彌散分布于胞漿，正常卵巢間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)陰性。正常卵巢組織、良性、交界性卵巢上皮腫瘤及卵巢癌中Ezrin的陽性率分別為100%、100%、55.6%、68.8%，呈下降趨勢(P=0.026)，E-cadherin的陽性率分別為71.4%、63.6%、66.7%、41.4%(P=0.093)。而EGFR的陽性率呈上升趨勢(P＜0.000 1)，分別為0%、63.6%、55.6%、88.6%，見表1。

項目分類卵巢癌正常卵巢組織例數(shù)良性卵巢上皮性腫瘤例數(shù)交界性卵巢上皮性腫瘤例數(shù)Ezrin -++ +率(%) 0 100.0 +++ 0700 00 0362 4401 %-++ + 7/7100 42.9 14.3 14.3 42.9 71.4 100 11/115/9 E-cadherin +++ 2113 4214 3024 7/11 5/7 6/9 EGFR %-++ + +++ % 7000 4304 4221 0/0 0000 7/11率(%) 0 27.3 54.5 18.2 100 36.4 18.2 0.9 36.4 63.6 36.4 27.3 0 36.4 63.65/9率(%) 44.4 44.4 0 11.1 55.6 33.3 0 22.2 44.4 66.7 44.4 22.2 22.2 11．1 55.6例數(shù)24 27 17 9 53/77 45 11 5 16 32/77 9 25 19 24 68/77率(%) 31.2 35.1 22.1 11.7 68.8 58.4 14.3 0.65 20.8 41.6 11.7 32.5 24.8 31.2 88.3

2.2 Ezrin、E-cadherin和EGFR與卵巢癌臨床病理因素的差異分析早、中期(Ⅰ/Ⅱ期)卵巢癌Ezrin及E-cadherin的表達(dá)高于晚期(Ⅲ/Ⅳ期)病例(P=0.031及0.029)，Ezrin及E-cadherin的表達(dá)與FIGO分期及組織學(xué)分級呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。E-cadherin的表達(dá)與腹腔轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。早、中期(Ⅰ/Ⅱ期)卵巢癌EGFR的表達(dá)低于晚期(Ⅲ/Ⅳ期)病例，并與FIGO分期呈正相關(guān)(P＜0.05)。EGFR的表達(dá)與腹腔轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P＜0.05)。Ezrin、E-cadherin及EGFR的表達(dá)與組織學(xué)類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，見表2。

注：aP＜0.05。

2.3 Ezrin、E-cadherin和EGFR的表達(dá)與卵巢癌患者的生存分析應(yīng)用Kaplan-Meier法生存分析，Ezrin蛋白陽性者(2-censored)中位無進(jìn)展生存時間為50.00個月，而低表達(dá)(1-censored)或缺失者(0-censored)為31.00及14.97個月，其陰性及低表達(dá)者累積生存率比陽性及強(qiáng)陽性者(2、3-censored)低(P＜0.000 1)，預(yù)后差。E-cadherin表達(dá)陰性及低表達(dá)(0、1-censored)患者中位無進(jìn)展生存時間為21.90及35.00個月，陽性及強(qiáng)陽性者(2、3-censored)為48.00及67.00個月，其陰性及低表達(dá)患者累積生存率比陽性及強(qiáng)陽性低(P＜0.000 1)，預(yù)后差。而EGFR表達(dá)陰性及低表達(dá)(0、1-censored)患者中位無進(jìn)展生存時間為54.00個月，陽性及強(qiáng)陽性者(2、3-censored)為17.87、11.63個月，其陰性及低表達(dá)者累積生存率比陽性及強(qiáng)陽性者高(P＜0.000 1)，預(yù)后好，如圖1、2、3。

圖1 Ezrin表達(dá)與卵巢癌患者累積生存率的關(guān)系

圖2 E-cadherin表達(dá)與卵巢癌患者累積生存的關(guān)系

圖3 EGFR表達(dá)與卵巢癌患者累積生存率的關(guān)系

2.4 Ezrin、E-cadherin和EGFR的表達(dá)與卵巢癌患者的單因素及多因素Cox生存回歸分析單因素生存分析中顯示，總生存期與FIGO分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹腔種植、Ezrin蛋白低表達(dá)或缺失、E-cadherin蛋白低表達(dá)或缺失以及EGFR的陽性表達(dá)有關(guān)(P＜0.05)，而與年齡、組織學(xué)分級、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腹腔種植無關(guān)(P＞0.05)。將Ezrin、E-cadherin和EGFR分別納入與年齡、FIGO分期、組織學(xué)分級、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹腔種植的多因素Cox生存回歸模型，顯示FIGO分期、Ezrin、E-cadherin和EGFR為累積生存率的獨立危險因素。Ezrin、E-cadherin陽性表達(dá)患者相對危險度[(exp(β)值)]比陰性患者低，且隨陽性表達(dá)的升高，相對危險度呈下降趨勢(P＜0.000 1)。而EGFR陰性表達(dá)患者相對危險度比陽性患者低，隨陽性表達(dá)的升高，相對危險度呈升高(P＜0.000 1)，見表3。

表3 Ezrin、E-cadherin及EGFR的表達(dá)在卵巢癌患者的單因素及多因素Cox生存回歸分析

2.5 Ezrin、E-cadherin和EGFR的表達(dá)的相關(guān)性Kendall's tau-b相關(guān)分析顯示，Ezrin的表達(dá)與E-cadherin呈正相關(guān)(P＜0.000 1)，與EGFR呈負(fù)相關(guān)(P=0.003)。而E-cadherin與EGFR無相關(guān)性。

3 討論

Ezrin廣泛分布在包含肌動蛋白的細(xì)胞微絨毛與微皺襞中，通過氨基端與細(xì)胞膜相連，羧基端與細(xì)胞骨架(肌動蛋白)相連，具有維持細(xì)胞形態(tài)、運動、連接粘附分子及調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Ezrin在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，其過量表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究中Ezrin表達(dá)陰性患者累積生存率比陽性患者低，預(yù)后差。這與在國內(nèi)外其他腫瘤如結(jié)腸癌與肺腺癌的研究結(jié)果相符[3-5]，也與國內(nèi)在卵巢癌中的研究一致[6]，但在非上皮性腫瘤中Ezrin與惡性程度不相關(guān)[7]。這提示了Ezrin可能在不同類型的活體細(xì)胞中有不同的功能。有研究認(rèn)為卵巢癌中Ezrin的丟失是由于編碼基因有缺失[8-9]。而Ezrin的表達(dá)與組織學(xué)分級呈負(fù)相關(guān)可能與隨腫瘤的去分化、腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)。Ezrin是具有形態(tài)學(xué)功能的蛋白，Ezrin表達(dá)的減少可能導(dǎo)致低分化卵巢癌細(xì)胞極性損害，本研究中24例Ezrin陰性的卵巢癌患者多為中-低分化，高分化只有3例。

E-cadherin屬于鈣依賴粘附分子的Cadherin家族，分子量120 kD，編碼該蛋白的基因位于16q22.1，位于上皮中間連接上的跨膜糖蛋白上，通過膜相關(guān)蛋白Catenin與細(xì)胞骨架肌動蛋白相連，介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附。體外實驗研究表明E-Cadherin表達(dá)的減少導(dǎo)致細(xì)胞變形如細(xì)胞形態(tài)的改變、細(xì)胞連接的松弛、細(xì)胞分裂及細(xì)胞能動性增加。免疫組化研究表明在多種腫瘤中E-Cadherin及Catenins的丟失常常與低分化、高侵襲率、高轉(zhuǎn)移率及更低的生存率有關(guān)。本研究中E-Cadherin在卵巢癌中低表達(dá)，隨FIGO分期、組織學(xué)分級的增高其陽性表達(dá)率下降，這與Ezrin的趨勢相一致。有研究發(fā)現(xiàn)Ezrin通過對腫瘤細(xì)胞表面粘附分子(如E-cadherin)的調(diào)節(jié)作用影響腫瘤的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移[10-12]。E-Cadherin和Catenin家族通過其細(xì)胞內(nèi)羧基端與Ezrin連接，形成了E-Cadherin、Catenin與Ezrin復(fù)合體，影響細(xì)胞骨架蛋白的構(gòu)象和分布，改變腫瘤細(xì)胞的運動、遷徙及粘附能力[13]，其共同影響機(jī)制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞粘附機(jī)理須進(jìn)一步深入研究。

EGFR是原癌基因c-erbB-l的表達(dá)產(chǎn)物，分子量為170 kD，編碼該蛋白的基因位于7號染色體短臂。許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與EGFR密切相關(guān)，在腫瘤組織以及腫瘤患者的血清中可以檢測到高水平的EGF和EGF受體，腫瘤細(xì)胞可以自分泌EGF以及通過其他組織細(xì)胞產(chǎn)生EGF，再作用于受體而發(fā)揮作用[14]。EGFR與相應(yīng)配體結(jié)合后能促進(jìn)細(xì)胞分裂和增生，同時EGFR具有酪氨酸蛋白激酶活性，當(dāng)EGFR與EGF及其相關(guān)蛋白結(jié)合后，酪氨酸殘基自身磷酸化激活受體激酶，引起一系列生物學(xué)效應(yīng)[15]。此外，EGFR受體的激活也能影響惡性細(xì)胞特性，有助于惡性表型的轉(zhuǎn)化。本研究中，EGFR在正常卵巢中為陰性表達(dá)，在卵巢癌中表達(dá)率顯著性增高，這與在膀胱、食管、肺及胃等器官的腫瘤組織進(jìn)行EGFR檢測結(jié)果相一致[13]。本研究中隨著卵巢癌發(fā)展、腹腔種植的出現(xiàn)，F(xiàn)IGO分期的增加，中、早期(Ⅰ/Ⅱ期) EGFR的表達(dá)顯著低于晚期(Ⅲ/Ⅳ期)患者(P=0.026)。EGFR表達(dá)陽性的腫瘤具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移力和侵襲性。

相關(guān)分析顯示，Ezrin與E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)，與EGFR呈負(fù)相關(guān)，提示三者在作用機(jī)制上相互影響，EGF可能通過與EGFR的結(jié)合，通過細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控Ezrin的表達(dá)，這與胡雪梅等[16]的研究一致。E-cadherin可能通過與Catenin家族羧基端與Ezrin連接，形成了E-Cadherin、Catenin與Ezrin復(fù)合體，影響細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的構(gòu)象和分布。三者具體相互作用尚需進(jìn)一步深入研究。

本研究中經(jīng)單因素及多因素Cox生存回歸分析，Ezrin和E-cadherin陰性表達(dá)患者的累積生存率明顯縮短，而EGFR陰性表達(dá)患者累積生存率高，Ezrin、E-cadherin的陰性表達(dá)及EGFR的陽性表達(dá)是卵巢癌患者生存獨立危險因素。根據(jù)其檢測結(jié)果可判斷卵巢癌患者的預(yù)后，并指導(dǎo)臨床化療期限的選擇，對陽性患者應(yīng)增加化療療程及提高化療力度，以增強(qiáng)治療效果。

[1]Hunter KW.Ezrin,a key component in tumor metastasis[J].Trends Mol Med,2004,10(5):201-204.

[2]RemmeleW,Stegner HE.Vorshlag zur einheitlichen Definition eines Immunreaktiven Score(IRS)für den Immunhistochemischen Oestrogen-Rezeptor-Nachweis(ER-ICA)im Mammakarzinomgewebe[J].Pathologe,1987,8:138-140.

[3]Bauske R,Milovic V,Turchanowa L,et al.EGF-stimulated polyamine accumulation in the colon carcinoma cell line,Caco-2[J]. Digestion,2000,61(4):230-236.

[4]Tokunou M,Niki T,Saitoh Y,et al.Altered expression of the ERM proteinsinlungadenocarcinoma[J].LabInvest,2000,80:1643-1650.

[5]張偉,劉媛媛,徐東來,等.E-cadherin和Ezrin在大腸癌組織中的表達(dá)及意義[J].中國實驗診斷學(xué),2010,14(4):563-566.

[6]任玉峰,李艷芳.Ezrin蛋白在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及臨床意義[J].實用癌癥雜志,2009,24(6):576-583.

[7]Makitie T,Carpe′n O,Vaheri A,et al.Ezrin as a prognostic indicator and its relationship to tumor characteristics in malignant uveal melanoma[J].Inv Oft Vis Sci,2001,42:2442-2449.

[8]Kiechle M,Jacobsen A,Schwarz-Boeger U,et al.Comparative genomic hybridization detects genetic imbalances in primary ovarian carcinomas ascorrelatedwithgradeofdifferentiation[J].Cancer,2001,91:534-540.

[9]Shridhar V,Lee J,Pandita A,et al.Genetic analysis of early-versus late-stage ovarian tumors[J].Cancer Res,2001,61:5895-5904.

[10]Moilanen J,Lassus H,Leminen A.Ezrin immunoreactivity in relation to survival in serous ovarian carcinoma patients[J].Gynecol Oncol,2003,90(2):273-281.

[11]Ohtani K,Sakamoto H,Rutherford T.Ezrin,a membrane-cytoskeletal linking protein is highly expressed in atypical endometrial hyperplasia and uterine ndometrioid adenocarcinoma[J].Cancer Lett, 2002,179(1):79-86.

[12]Chen Z,Fadiel A,Feng Y.Ovarian epithelial carcinoma tyrosine phosphorylation cell proliferation and Ezrin translocation are stimulated by interleukin lalpha and epidermal growth factor[J].Cancer, 2002,92(12):3068-3075.

[13]Dominguez-Escrig JL,Kelly JD,Neal DE,et al.Evaluation of the therapeutic potentail of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor gefitinibin preclinical models of bladder cancer [J].Clin Cancer Res,2004,10(14):4874-4884.

[14]Jakus J,Yeudall WA.Growth inhibitory concentrations of EGF induce p21(WAF1/Cipl)and alter cellcycle control in squamous carcinoma cells[J].Oncogene,1996,12(11):2369-2237.

[15]Wells A.The epidermal growth factor receptor and its ligands[J]. Cancer Treat Res,1989,47(2):143-149.

[16]胡雪梅,張繼學(xué),王瑞軍,等.Ezrin、E-cadherin和β-catenin在卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].蘭州大學(xué)學(xué)報,2010,36(1): 31-43.

Expression of Ezrin,E-cadherin and EGFR protein in epithelial ovarian neoplasms and its clinical significance.

XIAN Li-ying,YIN You-qun,ZHAO Dong-hui,ZHAO Ji-hong,YE Wei-biao.Department of Pathology,Dongguan People's Hospital,Dongguan 523000,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo study the expression and clinical significance of Ezrin,E-cadherin and EGFR in epithelial ovarian neoplasms.MethodsWe examined expressions of Ezrin,E-cadherin and EGFR in 77 ovarian carcinomas,11 benign tumors and 9 borderline epithelial ovarian tumors and 7 normal ovarian tissue samples by S-P immunohistochemistry,respectively.ResultsEzrin and E-cadherin had a declining expression in normal ovarian tissue, benign tumor,borderline epithelial ovarian tumors and ovarian carcinomas,but EGFR had a rising expression.The expression of Ezrin and E-cadherin revealed a negative correlation with clinical stages but a positive correlation with the EGFR in ovarian carcinomas.In univariate analysis,negative expression of Ezrin and E-cadherin was associated with shorter survival,but negative expression of EGFR was correlated with longer survival.Cox multivariate survival analysis showed that negative expression of Ezrin and E-cadherin and positive expression of EGFR had independent effect on survival.ConclusionEzrin may be an independent adverse prognostic factor of ovarian cancer.Ezrin,E-cadherin and EGFR together influence epithelial ovarian neoplasm to invasion and metastasis.

Ezrin;E-cadherin;EGFR;Ovarian carcinoma;Prognosis

R737.31

A

1003—6350（2013）18—2653—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.18.1106

2013-03-16)

冼麗英。E-mail：xinliyin@163.com