低溫厭氧氨氧化生物濾池細(xì)菌群落沿層分布規(guī)律

曾濤濤，李冬，劉濤，邱文新，蔡言安，許達，張杰,

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱，150090；2.北京工業(yè)大學(xué) 水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程北京市重點實驗室，北京，100124)

厭氧氨氧化工藝(Anaerobic ammonia oxidation，ANAMMOX)是目前最簡捷和最經(jīng)濟的生物脫氮途徑，是指在厭氧的條件下，以亞硝酸氮為電子受體，氨氮作為電子供體生成氮氣的過程[1]。反應(yīng)式如下：

與傳統(tǒng)硝化-反硝化工藝相比，厭氧氨氧化具有需氧量低、運行費用低、污泥產(chǎn)量低和無需外加碳源等優(yōu)點[2]，已成為廢水生物脫氮研究中的熱點。厭氧氨氧化菌是一群分支很深的浮霉?fàn)罹駷橹?，通過分子生物學(xué)檢測手段已經(jīng)在不同地點的人工或天然生態(tài)系統(tǒng)中鑒定了 5種不同的“Candidatus”ANAMMOX 菌屬，分別為Brocadia，Kuenenia，Jettenia，Anammoxoglobus和Scalindua[3]。氨氧化細(xì)菌(AOB)也是通過氧化氨來獲取能量的自養(yǎng)菌，有研究發(fā)現(xiàn) AOB能夠在厭氧氨氧化反應(yīng)器內(nèi)生存[4]；Nitrosomonas eutropha菌屬AOB能在氧受限的條件下，發(fā)生以亞硝酸氮為電子受體的厭氧氨氧化反應(yīng)[5]。這些報道表明，關(guān)于厭氧氨氧化菌與好氧氨氧化菌之間關(guān)系的研究有助于提高生物脫氮反應(yīng)器的性能。目前，關(guān)于ANAMMOX工藝的研究主要是針對污泥消化回流液和垃圾滲濾液等高氨氮廢水方面，最適溫度通常在30～40 ℃之間[6]，對較低溫度下的厭氧氨氧化報道較少。關(guān)于ANAMMOX微生物方面的研究，主要是厭氧氨氧化菌在反應(yīng)器的富集以及對該菌的分子生物學(xué)鑒定，對ANAMMOX反應(yīng)器不同部位微生物群落分布進行系統(tǒng)研究比較少。本研究中厭氧氨氧化反應(yīng)溫度在 14.9～16.2 ℃之間，用低溫厭氧氨氧化表示[7-8]。本文作者通過對低溫穩(wěn)定運行的上流式厭氧氨氧化生物濾池沿層取樣，利用掃描電鏡(SEM)、變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)和克隆測序等方法對細(xì)菌、ANAMMOX和AOB群落結(jié)構(gòu)進行系統(tǒng)分析，探索生物濾池微生物群落沿層分布特征，以便為提高反應(yīng)器效能研究提供便利。

1 材料與方法

1.1 反應(yīng)器

試驗裝置為有效容積 45 L的圓柱形密閉有機玻璃生物濾柱，內(nèi)徑185 mm。柱內(nèi)裝填粒徑為4～6 mm的火山巖填料，填料高度為190 cm。反應(yīng)器通過接種厭氧氨氧化污泥啟動成功，通過添加硫酸銨與亞硝酸鈉配置實驗用水，使得-N與的摩爾比(n(-N)∶n(-N))約為 1∶1.31，以符合厭氧氨氧化反應(yīng)基質(zhì)比例要求，氨氮質(zhì)量濃度約為200 mg/L。另外添加1.5%的生活污水A/O(厭氧/好氧)除磷工藝的二級處理出水[9]。采用上向流進水方式，進水pH為7.2，溫度為冬季室溫(14.9～16.2 ℃)，水力停留時間(HRT)為1.2 h，進水總氮負(fù)荷為4.8 kg/(m3·d)，水力負(fù)荷為3.0 m3/(m2·d)。

1.2 生物膜形態(tài)觀察

在反應(yīng)器上、中、下3部位分別收集厭氧氨氧化生物膜，按Wang等[10]介紹的方法處理樣品，通過掃描電鏡 (HITACHI S-4300) 觀察生物膜微觀結(jié)構(gòu)。

1.3 變性凝膠梯度電泳

1.3.1 總DNA提取

在反應(yīng)器上、中、下3部位各取200 mL含紅色污泥的生物膜水樣，于轉(zhuǎn)速為12 000 r/min、溫度為4℃的條件下離心10 min，收集沉淀。沉淀加入10 mL，濃度為0.1 mol/L的PBS (pH8.0)重懸2次。參考Zhou等[11]給出的細(xì)菌總DNA提取方法提取細(xì)菌總DNA。

1.3.2 PCR擴增

采用通用引物 BSF338-GC和 BSR518擴增細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)片斷[12]。采用特異性引物amx368-GC和amx820擴增厭氧氨氧化16S rRNA基因[13]。對于AOB細(xì)菌，采用引物amoA-1F-GC與amoA-2R擴增AOB功能基因amoA[14]。3種引物信息如表1所示。PCR產(chǎn)物按 DNA純化回收試劑盒(天根)操作說明進行純化回收。

表1 PCR-DGGE所用引物信息Table 1 Summary of primer information for PCR-DGGE

1.3.3 DGGE及其結(jié)果分析

采用美國Bio-Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統(tǒng)對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳分離，電泳條件如下： 凝膠變性梯度為30%～60%，聚丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8% (BSF338-GC/BSR518)和 6%(amx368-GC/amx820，amoA-1F-GC/amoA-2R)，電壓為 120 V，緩沖液為1×TAE，溫度為 60 ℃，電泳時間分別為 5 h(BSF338-GC/BSR518)，8 h(amx368-GC/amx820)和 10 h(amoA-1F-GC/amoA-2R)。電泳結(jié)束后對凝膠進行銀染[15]，染色圖譜通過數(shù)碼相機獲取。

對 DGGE圖譜通過軟件 Quantity One 4.6.0(Bio-Rad，USA)進行分析，其中微生物群落多樣性用Shannon-Weaver指數(shù)(H)表示[16]，其計算公式為：H=-∑PilnPi(其中Pi表示每個峰面積占總面積的比值)。而相關(guān)性分析主要分析反應(yīng)器不同部位微生物種群相似性。

1.4 ANAMMOX菌與AOB系統(tǒng)發(fā)育分析

對于ANAMMOX菌與AOB DGGE凝膠上條帶進行切膠溶于100 μL 1×TE中，在4 ℃ 冰箱中放置24 h。以此為模板，相應(yīng)不帶 GC夾的 amx368/amx820與amoA-1F/amoA-2R為引物，擴增厭氧氨氧化菌16S rRNA基因與 AOB 功能基因amoA。將回收的 PCR產(chǎn)物連接到載體 pMD19-T (TaKaRa)上，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coliDH5α(天根)中去。通過藍(lán)白斑篩選陽性克隆并送交生工生物公司進行測序。獲得的序列通過NCBI網(wǎng)站的 BLAST工具在GenBank中搜索相近序列。將該序列與已發(fā)表的相關(guān)序列進行比對，通過MEGA 5.0軟件，以bootstrap-NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[17]。本研究所得的ANAMMOX菌16S rRNA基因序列與 AOB細(xì)菌amoA基因序列已提交至GenBank，登錄號分別為JN659913與JN659914。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物濾池沿層脫氮效果

反應(yīng)器出水平均pH為8.2，比進水pH (7.2)高，原因是ANAMMOX過程中主要消耗氫離子從而造成pH 升高。目前關(guān)于低溫(＜20 ℃)厭氧氨氧化報道尚少， Dosta等[18]研究了溫度對厭氧氨氧化的影響，發(fā)現(xiàn)溫度＜20 ℃條件下，厭氧氨氧化總氮去除負(fù)荷＜0.5 kg/(m3·d)。Winkler等[19]研究了在溫度(18±3) ℃條件下厭氧氨氧化顆粒污泥反應(yīng)器脫氮效果，發(fā)現(xiàn)總氮去除負(fù)荷為 0.9 kg/(m3·d)。在本研究中，反應(yīng)器在較低溫度下(14.9～16.2 ℃)總氮去除負(fù)荷達 2.4 kg/(m3·d)，表明火山巖生物濾池反應(yīng)器即使在低溫下也具有極高的厭氧氨氧化脫氮效果。

為了更清楚地了解反應(yīng)器沿層氮素變化情況，對生物濾柱沿進水方向每隔 10 cm取樣，對反應(yīng)器上(140～190 cm)、中(60～140 cm)、下(10～60 cm) 3 部分氮素變化進行分析，結(jié)果如圖1所示。從圖1可見：沿濾層進水方向，氨氮和亞氮成比例消耗，總氮去除負(fù)荷也不斷提高。經(jīng)計算，發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)器下部即進水端，消耗的n(-N)∶n(-N)=1∶1.02，大于厭氧氨氧化反應(yīng)理論消耗n(-N)∶n(-N)(1∶1.31)。推測其原因是生物濾柱下部存在 AOB，能夠氧化一部分N。進水中的-N和-N 去除集中在生物濾柱中部(60～140 cm)，且中部n(-N)∶n(-N)為 1∶1.31，符合厭氧氨氧化反應(yīng)基質(zhì)消耗的摩爾比，表明生物濾柱中部微生物以ANAMMOX菌為主。而在反應(yīng)器上部，消耗的n(-N)∶n(-N)=1∶1.33,小于厭氧氨氧化反應(yīng)理論消耗n(N)∶nN)(1∶1.31)；同時，反應(yīng)器上部積累了一定量的硝氮(20 mg/L)，硝氮產(chǎn)生量與氨氮消耗量之摩爾比n(Δ3N)∶n(Δ-N)=0.23，小于理論n(Δ-N)∶n(Δ-N)(0.26)，表明在反應(yīng)器上部有一部分亞氮和硝氮以非厭氧氨氧化方式損失，推測反應(yīng)器上部存在反硝化微生物，負(fù)責(zé)小部分亞氮和硝氮的去除。

圖1 生物濾柱沿層脫氮情況Fig.1 Nitrogen removal along biofilter layer

2.2 微生物形態(tài)分析

在反應(yīng)器運行過程中，觀察到生物膜上ANAMMOX菌所特有的紅色沿水流方向存在明顯的深淺變化，下部分生物膜呈暗褐色，中部分生物膜呈桃紅色，上部分生物膜逐漸轉(zhuǎn)為暗紅色，這反映ANAMMOX 生物量并不是均勻分布的。為了更詳細(xì)了解生物濾柱沿層生物膜微觀結(jié)構(gòu)，對上、中、下 3部分生物膜通過掃描電鏡進行觀察，結(jié)果如圖2所示。上部分微生物形態(tài)不一，種類比較多，存在球形、桿形、弧形細(xì)菌及較多的絲狀菌；中部分微生物幾乎全是直徑1 μm的球形細(xì)菌，分布密集；下部分微生物存在球狀、橢球狀和桿狀細(xì)菌。

已報道的厭氧氨氧化細(xì)菌形態(tài)主要為球形，直徑在0.8～1.1 μm之間[20]。通過掃描電鏡對中部球形細(xì)菌放大10 000倍(圖2(d))，能更清楚地觀察這種球形細(xì)菌的特征：球形細(xì)胞表面并不十分光滑，存在一些細(xì)點狀凸起；細(xì)胞之間存在細(xì)絲狀連接，可能是細(xì)菌的分泌物，有助于細(xì)菌在填料表面附著生長。這些特征與已報道的厭氧氨氧化菌特征非常吻合[21]。這從微觀上證實了 ANAMMOX 生物主要分布在反應(yīng)器中部的推測，這也是氮素大部分在反應(yīng)器中部被去除的原因。

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)沿層分析

細(xì)菌DGGE 上、中、下3條泳道上共觀察到12條不同的條帶，見圖3(a)；對DGGE圖譜經(jīng)過Quantity One 4.6.0分析繪制示意圖，見圖3(b)，其中12條橫線位置及橫線顏色深淺，可以反映各條帶的分布與相對強度，也得到反應(yīng)器內(nèi)中，下部與上部細(xì)菌種群的相似性分別為 80.2%和 62.6%。另外，計算出微生物群落Shannon-Weaver指數(shù)H上，H中與H下分別為1.30，0.83和0.67。

DGGE凝膠上的條帶與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，不同位置的條帶代表著不同的細(xì)菌種類，條帶的數(shù)量反映了群落的多樣性。由圖 3(a)可知：反應(yīng)器內(nèi)共只有12條不同位置的條帶，表明細(xì)菌多樣性不是很高，這可能與反應(yīng)器進水采用無機配水有關(guān)。條帶5，8，9和10在反應(yīng)器上、中、下部分都出現(xiàn)，這些條帶代表的4類細(xì)菌在反應(yīng)器上、中、下3部分都存在，分布比較均勻；上、中、下3部分DGGE條帶數(shù)目分別為10，7和6， Shannon-Weaver指數(shù)也是H上＞H中＞H下，這表明生物濾柱上部分細(xì)菌多樣性最高，中部其次，下層細(xì)菌多樣性最低。推測其原因是在生物濾柱進水端(下部)，氨氮、亞氮濃度及水力負(fù)荷都很高，能夠適應(yīng)這種條件的細(xì)菌比較少。同時，這些細(xì)菌會消耗進水中的微量溶解氧，為反應(yīng)器創(chuàng)造厭氧環(huán)境。在生物濾柱中部，氨氮、亞氮質(zhì)量濃度降低，厭氧環(huán)境適宜，因而會形成以ANAMMOX菌為主的微生物群落結(jié)構(gòu)。在生物濾柱上部存在反硝化現(xiàn)象，因而反應(yīng)器上部可能存在反硝化微生物；同時，下、中部的一些微生物也會隨水流到達上部，使得上部微生物種類較多。微生物群落結(jié)構(gòu)沿層變化是適應(yīng)生物濾柱沿層氮素變化的結(jié)果。

圖2 厭氧氨氧化生物濾池沿層微觀結(jié)構(gòu)觀察Fig.2 Microstructure of different parts in ANAMMOX biofilter

圖3 厭氧氨氧化生物濾池上、中、下部位微生物DGGE結(jié)果Fig.3 DGGE results of upper, middle, and lower parts in ANAMMOX biofilter

2.4 ANAMMOX與AOB群落結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育分析

上、中、下3部分ANAMMOX的 DGGE結(jié)果(見圖3(c))與AOB的DGGE結(jié)果(見圖3(d))都分別只有1個條帶，表明生物濾池沿層中 ANAMMOX與 AOB都分別只有1個種類，這與其他有關(guān)ANAMMOX在反應(yīng)器內(nèi)種類分布的研究結(jié)果一致[22]。在同一生態(tài)系統(tǒng)中，很少發(fā)現(xiàn)2個厭氧氨氧化種群同時出現(xiàn)，表明每一種厭氧氨氧化菌都有自己獨特的特性與特定的生態(tài)系統(tǒng)[23]。

對ANAMMOX菌進行菌屬鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖 4)，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)器內(nèi)存在的 ANAMMOX 菌(JN659913 anammox bacteria)為Candidatus Kuenenia stuttgartiensis。這種 ANAMMOX 菌最早發(fā)現(xiàn)于生物濾池中[24]，菌體呈球狀，直徑為1 μm左右，化能自養(yǎng)型，本研究中ANAMMOX菌與這些特征相吻合。一般文獻報道厭氧氨氧化工藝都是在較高的溫度(30～40 ℃)下運行，本實驗中厭氧氨氧化生物濾池在低溫下(14.9～16.2 ℃)也有很高的總氮去除負(fù)荷，顯示Candidatus Kuenenia stuttgartiensis能夠在低溫下穩(wěn)定生長并保持較高的生物活性，因而，可以通過富集Candidatus Kuenenia stuttgartiensis來維持厭氧氨氧化工藝在較低溫度下(16 ℃左右)穩(wěn)定運行。

在生物濾柱運行過程中，并沒有把進水中的溶解氧去除，進水中存在較低的溶解氧，因而，反應(yīng)器出現(xiàn)能夠利用氨氮來獲取能量的自養(yǎng)需氧菌AOB。但反應(yīng)器處于低溫、低溶解氧的環(huán)境，不具備 AOB適宜的生長繁殖條件，因而，反應(yīng)器內(nèi) AOB種類單一，只有1種。通過克隆測序鑒定AOB菌屬，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖5。圖5中JN659914 AOB amoA代表生物濾池中 AOB和已知氨氧化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。發(fā)現(xiàn)生物濾池中 AOB與Nitrosomonas sp.ENI-11(AB079055.1)同源性最高，相似度達 98%。Nitrosomonas sp.ENI-11屬于亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)，Nitrosomonas為污水生物脫氮系統(tǒng)中比較常見 AOB菌屬，其能夠在低溶解氧環(huán)境下生存[5]。此類 AOB的存在能夠消耗進水中的微量溶解氧，為反應(yīng)器創(chuàng)造厭氧環(huán)境，有利于生物濾柱中部富集較多的ANAMMOX菌，發(fā)揮厭氧氨氧化脫氮效果。

圖4 基于16S rDNA序列構(gòu)建的厭氧氨氧化細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of ANAMMOX bacteria based on 16S rDNA sequences

圖5 基于amoA基因氨氧化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.5 Phylogenetic tree of AOB based on amoA gene sequences

3 結(jié)論

(1) 大部分氨氮與亞氮在反應(yīng)器中部以厭氧氨氧化脫氮方式去除，反應(yīng)器即使在低溫(14.9～16.2 ℃)條件下也具有很好的脫氮效果，總氮去除負(fù)荷達 2.4 kg/(m3·d)。

(2) 反應(yīng)器中部微生物以類似 ANAMMOX菌的球形細(xì)菌為主。生物濾柱上部分細(xì)菌多樣性最高，中部其次，下層細(xì)菌多樣性最低。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)沿層變化是適應(yīng)生物濾柱沿層氮素變化的結(jié)果。

(3) 在反應(yīng)器上、中、下部位存在同一種厭氧氨氧化菌(ANAMMOX)與好氧氨氧化菌(AOB)。反應(yīng)器內(nèi)存在的 ANAMMOX菌為Candidatus Kuenenia stuttgartiensis，AOB為Nitrosomonas sp.ENI-11。

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