外加營(yíng)養(yǎng)源作用下磚紅壤中五氯酚還原轉(zhuǎn)化的 生物化學(xué)作用機(jī)制

陳曼佳，劉承帥，吳偉堅(jiān)，童輝，李芳柏*

1. 中國(guó)科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所，廣東 廣州 510640；

2. 廣東省農(nóng)業(yè)環(huán)境綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所，廣東 廣州 510650；3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100039

五氯酚（pentachlorophenol，PCP）是自然界中普遍存在的高毒、難降解的持久性有機(jī)氯污染物，在過(guò)去的30年中，五氯酚被廣泛應(yīng)用于殺蟲(chóng)、殺菌、防腐等生產(chǎn)生活領(lǐng)域[1-2]。PCP的大規(guī)模使用已經(jīng)造成了濕地、水體、土壤等大范圍的污染，并威脅到人類(lèi)的健康[3-5]。

氯酚在缺氧土壤環(huán)境中經(jīng)歷著緩慢的自然還原轉(zhuǎn)化過(guò)程[6-7]，包括非生物和生物轉(zhuǎn)化過(guò)程。氯酚在土壤中的非生物轉(zhuǎn)化通常是由各種潛在氧化還原劑引起，尤其是含低價(jià)態(tài)鐵及其鐵氧化物等自然礦物界面[6]。微生物在土壤地球化學(xué)過(guò)程中扮演著極其重要的角色。早在1986年，Valo和Salkinoja-salonen報(bào)道了Rhodococcus chlorophenolicus對(duì)土壤中苯氧基苯酚和多氯苯氧基苯甲醚進(jìn)行還原脫氯[8]。土壤中氯酚還原轉(zhuǎn)化通常既發(fā)生生物轉(zhuǎn)化，又同時(shí)伴隨著非生物轉(zhuǎn)化[9-10]。在厭氧土壤環(huán)境中，非生物和生物過(guò)程可能共同促進(jìn)氯酚的還原轉(zhuǎn)化過(guò)程。

在厭氧富鐵紅壤中，吸附態(tài)Fe（Ⅱ）被認(rèn)為是PCP還原轉(zhuǎn)化的活性物種[11-13]。但是，在土壤環(huán)境中的鐵大部分是以含鐵土壤礦物組成成分的形式存在，很難直接作用于PCP的還原轉(zhuǎn)化。在厭氧條件下，土壤氧化鐵能夠通過(guò)還原性有機(jī)酸 [14-15]和異化鐵還原微生物驅(qū)動(dòng)等作用產(chǎn)生大量的土壤礦物吸附態(tài)Fe（Ⅱ）物種[16]，從而促進(jìn)土壤中有機(jī)氯污染物的還原轉(zhuǎn)化。

玄武巖磚紅壤是廣東省熱帶地區(qū)代表性土壤，其鐵氧化物和有機(jī)質(zhì)的含量都較高[17]，因此，玄武巖磚紅壤中PCP具有活躍的環(huán)境地球化學(xué)過(guò)程，同時(shí)，其中的微生物群落結(jié)構(gòu)也與PCP轉(zhuǎn)化具有密切關(guān)系。但是，與之相關(guān)磚紅壤中PCP轉(zhuǎn)化的微生物作用過(guò)程機(jī)制，還需進(jìn)一步研究。

因此，本研究以玄武巖發(fā)育的磚紅壤為基質(zhì)，在中性厭氧環(huán)境下，系統(tǒng)研究PCP還原轉(zhuǎn)化過(guò)程及其微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，在此基礎(chǔ)上深入探討紅壤體系對(duì)PCP的消減能力及反應(yīng)機(jī)制，為促進(jìn)土壤中有機(jī)氯污染物的還原轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤樣品為玄武巖磚紅壤，采自廣東省雷州市唐家鎮(zhèn)（20°51′N(xiāo), 109°53′E），按多點(diǎn)采樣的方式采集深度為0~15 cm的土壤，土壤樣品在實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干后，去除動(dòng)植物殘?bào)w，過(guò)0.180 mm篩。供試土壤的理化性質(zhì)經(jīng)常規(guī)分析方法分析：土壤pH 4.79，有機(jī)質(zhì)含量25.1 g/kg，總鐵137.27 g/kg，絡(luò)合態(tài)鐵0.076 g/kg，無(wú)定形鐵1.879 g/kg，游離態(tài)鐵16.97 g/kg。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，反應(yīng)體系為0.5 g土壤（干質(zhì)量），PCP、哌嗪-1,4-雙（2-乙烷磺酸）（PIPES）、乳酸和蒽醌-2,6-磺酸鈉（AQDS）的初始濃度分別為0.019、30、10和0.2 mmol·L?1。通過(guò)PIPES緩沖溶液將pH值控制在7.0左右。反應(yīng)體系在20.2 mL的西林瓶中進(jìn)行，高純氮?dú)獬錃?0 min排氧，然后用橡膠塞壓緊并用鋁蓋密封。樣品置厭氧培養(yǎng)箱中（30 ± 1）℃靜置培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，測(cè)定樣品中目標(biāo)物、吸附態(tài)Fe（Ⅱ）、氧化還原電位、胞外電子傳遞數(shù)量以及微生物群落結(jié)構(gòu)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，文中所示數(shù)據(jù)均為數(shù)據(jù)平均值。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)條件 Table 1 Experimental design

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

反應(yīng)體系樣品中目標(biāo)物PCP采用1:1 (V:V)乙醇水溶液進(jìn)行提取后[18]，高效液相色譜（HPLC）測(cè)定；吸附態(tài)Fe(Ⅱ)由0.5 mol·L?1鹽酸提取[16]，其濃度采用分光光度計(jì)測(cè)定，活性鐵物種的氧化還原電位（Ep）采用循環(huán)伏安法（CV）與傳統(tǒng)的三電極體系測(cè)試[19]，胞外電子傳遞數(shù)量采用微生物燃料電池(MFC)的方法進(jìn)行測(cè)定[19]。具體的測(cè)試方法及過(guò)程見(jiàn)參考文獻(xiàn)[20]。土壤滅菌處理采用γ射線(xiàn)輻照滅菌（60Co源，輻照劑量為50 kGy）[21]。

1.4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法

1.4.1 土壤DNA提取

土壤DNA提取采用MO BIO公司的PowerSoilTMDNA試劑盒進(jìn)行提取，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.2 細(xì)菌16S rRNA片段的PCR擴(kuò)增和純化

采用通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA。正向引物為27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′），反向引物為1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），其中正向引物5′用6-羧基二乙酸熒光素（FAM）標(biāo)記，用于末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（T-RFLP）實(shí)驗(yàn)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成標(biāo)記。PCR的反應(yīng)體系如下：總體積25 μL，其中Ex Taq DNA聚合酶（TAKARA）1 U，聚合酶緩沖溶液2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，正反向引物各0.4 μmol·L?1，模板50 ng，補(bǔ)充無(wú)菌水至25 μL。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃ 4 min，30個(gè)循環(huán)為：94 ℃ 1 min；55 ℃ 1 min；72 ℃ 1.5 min；72 ℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用純化試劑盒（OMEGA）純化，具體方法流程按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.3 末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（T-RFLP）試驗(yàn)

末端熒光標(biāo)記的PCR純化后產(chǎn)物用MspI（TAKARA）限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行消化，反應(yīng)體系為20 μL，其中酶8 U，10 × buffer 2 L，DNA 200 ng，37 ℃下消化3 h，然后升溫至70 ℃將酶滅活20 min。酶切產(chǎn)物的T-RFLP分析由上海基康生物技術(shù)有限公司完成。T-RFLP圖譜中限制性片段（T-RF）在50 ~ 550 bp，豐度小于1%的T-RFs不計(jì)入計(jì)算。T-RFs定性分析采用網(wǎng)站在線(xiàn)分析（http：//trflp.limnology.wisc.edu/index.jsp），選擇在線(xiàn)分析中的PAT（The T-RFLP Phylogenetic Assignment Tool）工具。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCP轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)

圖1 不同反應(yīng)條件下PCP還原轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué) Fig. 1 Reductive transformation kinetics of PCP

PCP在玄武巖磚紅壤中的還原轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)如圖1所示。由圖可知，在滅菌體系中（SC處理），PCP沒(méi)有發(fā)生還原轉(zhuǎn)化。其他3個(gè)體系中，PCP的還原轉(zhuǎn)化速率依次為T(mén)3>T2>T1。在只有PIPES作為緩沖溶液的體系下（T1處理），反應(yīng)90 d之后，大約有10.8%的PCP發(fā)生轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)k為4.5 × 10?3d?1（R2= 0.943）。結(jié)果說(shuō)明了土壤中的微生物對(duì)PCP的還原轉(zhuǎn)化起著決定性作用。有文獻(xiàn)[22-24]報(bào)道，通過(guò)生物刺激的作用，可以提高土壤中土著微生物的活性，從而進(jìn)一步提高有機(jī)氯污染的脫氯轉(zhuǎn)化。在本研究中，當(dāng)添加外加營(yíng)養(yǎng)源乳酸作為電子供體時(shí)（T2處理），PCP轉(zhuǎn)化速率得到提高，17.5%的PCP發(fā)生轉(zhuǎn)化（k = 7.3 ×10?3d?1，R2= 0.947）。當(dāng)同時(shí)添加乳酸和電子介體AQDS時(shí)（T3處理），PCP的轉(zhuǎn)化速率進(jìn)一步提高，30.2%的PCP發(fā)生轉(zhuǎn)化（k = 14.3×10?3d?1，R2= 0.958）。結(jié)果表明，在外加營(yíng)養(yǎng)源作用下，供試磚紅壤中微生物活性提高，同時(shí)，電子介體能提高反應(yīng)體系中電子傳遞速率，從而提高PCP的還原轉(zhuǎn)化速率。

2.2 吸附Fe(Ⅱ)生成動(dòng)力學(xué)

Li等[11-12]研究表明，土壤中鐵物種的地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程能影響PCP還原轉(zhuǎn)化過(guò)程，還原性Fe(Ⅱ)物種能夠顯著促進(jìn)PCP還原轉(zhuǎn)化率。本研究供試土壤樣品具有較高的總鐵以及各種形態(tài)的鐵含量，因此本研究系統(tǒng)考察了PCP降解過(guò)程中活性鐵物種的生成動(dòng)力學(xué)，進(jìn)一步研究鐵物種對(duì)PCP轉(zhuǎn)化的影響。圖2為反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的吸附態(tài)Fe(Ⅱ)濃度變化。從圖中可以看出，在滅菌體系中，產(chǎn)生的吸附態(tài)Fe(Ⅱ)最高濃度只有0.18 mmol·L?1。而隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，T1-T3體系中，吸附態(tài)Fe(Ⅱ)濃度呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，說(shuō)明添加電子供體乳酸能促進(jìn)吸附態(tài)Fe(Ⅱ)物種的形成，而加入電子介體AQDS能進(jìn)一步提高體系當(dāng)中Fe(Ⅱ)生成量。

圖2 PCP還原轉(zhuǎn)化過(guò)程中吸附態(tài)Fe(Ⅱ)生成動(dòng)力學(xué) Fig. 2 Adsorbed Fe(Ⅱ) generation during the PCP transformation

2.3 反應(yīng)體系中氧化還原電位的變化

采用循環(huán)伏安法測(cè)定了T1-T3反應(yīng)體系中前10天活性鐵物種的氧化還原電位Ep，結(jié)果如圖3所示。T1體系中，在反應(yīng)后期Ep值沒(méi)有明顯變化；而T2和T3體系中，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，其Ep值不斷變小。這表明在T2和T3體系中，活性Fe(Ⅱ)物種的數(shù)量不斷增多，反應(yīng)體系的還原能力持續(xù)提高。Glass等[25]指出，土壤的氧化還原電位越低，土壤有機(jī)氯污染物的還原轉(zhuǎn)化速度越快，而還原態(tài)的Fe物種是影響淹水土壤中氧化還原狀態(tài)的重要因素之一。由此可見(jiàn)，T3處理中生成的吸附態(tài)Fe(Ⅱ)具有較強(qiáng)的還原能力，這也是T3體系中具有較高的PCP還原轉(zhuǎn)化效率的主要原因。

圖3 PCP還原轉(zhuǎn)化過(guò)程中氧化還原電位變化 Fig. 3 Change of redox potential (Ep) generated during the PCP transformation processes

2.4 PCP轉(zhuǎn)化過(guò)程中土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化

圖4 4個(gè)不同處理下土壤微生物的T-RFLP分析結(jié)果 Fig. 4 T-RFLP analysis of bacteria in four treatments

前面研究結(jié)果表明，在PCP還原脫氯過(guò)程中，土壤樣品中微生物起到重要的作用。因此，本研究采用T-RFLP方法對(duì)反應(yīng)7 d的T1-T3體系中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。實(shí)驗(yàn)過(guò)程設(shè)計(jì)不加PCP的處理（CK處理）供試土壤作為對(duì)照，研究PCP對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響。采用MspⅠ進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)生的片段類(lèi)型統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示，其中片段豐度小于5%的所有片段歸為一類(lèi)（圖中others所示），豐度大于10%定義為該處理?xiàng)l件下的優(yōu)勢(shì)種群。CK處理下，共檢測(cè)到14個(gè)T-RF片段；T1-T3處理,分別檢測(cè)到10、7和4個(gè)T-RF片段。具體每個(gè)T-RF代表物種類(lèi)型及豐度如表2所示。

表2 T-RFLP圖譜分析不同處理下土壤細(xì)菌主要種群 Table 2 Dominating bacteria based on T-RFLP profiles by PAT T-RFLP program

CK處理下，微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性最高，其優(yōu)勢(shì)種群為477 bp和484 bp，分別與根瘤菌和梭菌末端片段一致；T1處理下，其優(yōu)勢(shì)種群為120 bp和484 bp，分別與脂肪酸芽孢桿菌和梭菌末端片段一致；T2處理下，其優(yōu)勢(shì)種群為484 bp和518 bp，均與梭菌末端片段一致；T3處理下，其優(yōu)勢(shì)種群為286 bp和288 bp，均與梭菌末端片段一致。由此可以推測(cè)，在供試土壤樣品中，梭菌是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種群，尤其是添加乳酸和AQDS之后，其含量超過(guò)30%；由表2同時(shí)可知，T2處理中的片段509 bp與希瓦氏菌（典型鐵還原菌）片段一致。結(jié)果說(shuō)明，在外加營(yíng)養(yǎng)源作用下，與對(duì)照處理相比，鐵還原菌豐度增加。對(duì)4個(gè)處理下微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分分析（PCA）發(fā)現(xiàn)[26]，在研究的4個(gè)不同處理?xiàng)l件下，其微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異（圖5），第一主成分主要把添加PCP的樣品點(diǎn)與對(duì)照試驗(yàn)點(diǎn)分開(kāi)。T1-T3處理，其差異性主要表現(xiàn)在第二主成分。

圖5 4個(gè)不同處理下微生物群落結(jié)構(gòu)主成分分析 Fig. 5 Principal component analysis of microbial community in the four treatments

3 結(jié)論

在玄武巖磚紅壤中，存在一定豐度的希瓦氏菌，厭氧條件下，氧化鐵能被還原形成吸附態(tài)Fe(Ⅱ)物種，吸附態(tài)Fe(Ⅱ)是土壤有機(jī)氯還原轉(zhuǎn)化的重要活性物質(zhì)[11-12,27]。乳酸作為電子供體，為微生物提供可利用碳源[22]，外加乳酸時(shí)，土壤中的希瓦氏菌的豐度有所增強(qiáng)，促進(jìn)了土壤中吸附態(tài)Fe(Ⅱ)的形成，從而提高了PCP的還原轉(zhuǎn)化率。

醌基類(lèi)物質(zhì)如腐殖質(zhì)和AQDS作為電子介體，能提高體系的電子轉(zhuǎn)移速率[28]。因此，磚紅壤反應(yīng)體系中加入AQDS能顯著提高PCP的還原轉(zhuǎn)化率。

玄武巖磚紅壤中PCP還原轉(zhuǎn)化的活性物質(zhì)是吸附態(tài)Fe(Ⅱ)，希瓦氏菌是土壤中吸附態(tài)Fe(Ⅱ)生成的驅(qū)動(dòng)者。添加乳酸和AQDS促進(jìn)了吸附態(tài)Fe(Ⅱ)的生成，從而加速PCP的還原轉(zhuǎn)化。

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