氣道噴霧博來(lái)霉素建立特發(fā)性肺纖維化模型的研究

王聰 朱繪明 錢衛(wèi)平 韓曉冬

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種病因不明，以彌漫性肺泡炎、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，最終肺間質(zhì)纖維化為特征的疾病，發(fā)病人群主要為老年人［1］，是老年人慢性咳嗽的主要發(fā)病原因［2］。其臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難，限制性通氣障礙，最終呼吸衰竭導(dǎo)致死亡。目前臨床上治療效果差，治愈率低，5 年生存率只有30% ～50%［3］。為了更好地探究IPF的發(fā)病機(jī)制，需要建立與人類IPF 發(fā)展進(jìn)程相似的動(dòng)物模型，模擬人類IPF 發(fā)生過(guò)程中的發(fā)病特點(diǎn)。博萊霉素所致大鼠IPF 模型是目前公認(rèn)的最接近人類病理變化的模型，許多研究中采用該模型來(lái)評(píng)價(jià)各種治療肺纖維化方法的療效。但既往的造?；径际遣捎脷獾赖稳氲姆绞浇o藥，藥物在肺內(nèi)分布不均，影響實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)采用美國(guó)PENN-CENTURY 公司生產(chǎn)的霧化器通過(guò)氣管插管給予實(shí)驗(yàn)鼠博來(lái)霉素，建立IPF 動(dòng)物模型，藥物在肺內(nèi)分布更均勻，形成的纖維灶更均一。通過(guò)病理切片觀察，膠原染色、血?dú)夥治觥⑻禺惖鞍讬z測(cè)等方法，探討IPF 的病理進(jìn)程。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 雄性大鼠80 只，體質(zhì)量180 ～200 g，平均(192.0 ±7.6)g，8 周齡，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供。所有操作和實(shí)驗(yàn)流程均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 2 種方法伊文斯蘭染液分布的比較 經(jīng)氣管分別采用滴入或霧化向大鼠肺內(nèi)注入伊文斯蘭染液，給藥5 min 后斷頸處死大鼠，取其全肺，在PBS 中漂洗后放在濾紙上吸干表面液體，剝離肺周圍脂肪組織，觀察伊文斯蘭染液在肺組織中的分布［4］。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為2 組:模型組(40只)和對(duì)照組(40 只)。模型組按5 mg/kg 氣道給予博來(lái)霉素;對(duì)照組給予生理鹽水。

1.4 主要試劑與設(shè)備 鹽酸博來(lái)霉素(天津太河制藥有限公司);MicroSprayereTM霧化器(美國(guó)PENN-CENTURY);Tissue-Tek DRSTMHE 染色系統(tǒng)(SAKURA 公司生產(chǎn));羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所);Masson 染色試劑盒(南京建成生物工程研究所);動(dòng)脈采血器(BD 公司生產(chǎn));i-STAT 血?dú)夥治鰞x;i-STAT G3+血?dú)夥治隹ㄆ?兔抗鼠波形蛋白(vimentin)，兔抗鼠α-SMA，兔抗鼠E-鈣黏素，(一抗均為abcam 公司生產(chǎn))，HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG 抗體(南京生興生物技術(shù)有限公司)。

1.5 建造IPF 大鼠模型

1.5.1 麻醉、固定:大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(3 ml/kg)麻醉后仰面固定在60°傾斜鼠板上。

1.5.2 給藥:將光源直接照射于大鼠咽喉部皮膚表面，左手墊紗布向外向上提起舌頭，可見(jiàn)會(huì)厭，將霧化器的噴霧頭置于舌根與會(huì)厭的交界處，暴露聲門，將噴霧頭經(jīng)聲門裂輕輕插入氣管內(nèi)，立即霧化給藥博來(lái)霉素(5 mg/kg)予模型組，對(duì)照組用同樣方法給予生理鹽水。動(dòng)物清醒后隨意進(jìn)食。

1.5.3 標(biāo)本采集:2 組分別于第7、14、21、28 天4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用一次性動(dòng)脈采血針采集腹主動(dòng)脈血樣進(jìn)行血?dú)夥治?取血后斷頸處死動(dòng)物，剖開(kāi)胸腔，取下肺葉。

1.5.4 標(biāo)本處理:取右肺下葉于4%多聚甲醛中固定24 h，連續(xù)石蠟切片，做HE 染色和Masson 染色，取右肺上葉進(jìn)行羥脯氨酸含量測(cè)定，隨機(jī)取右肺中葉提取蛋白，進(jìn)行Western blot 檢測(cè)。左葉肺組織放于－80 ℃冰箱待用。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用(±s)表示，2 組間均數(shù)比較用t 檢驗(yàn);多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 伊文斯蘭染液在肺內(nèi)的分布 伊文斯蘭能將組織染成藍(lán)色，以伊文斯蘭作為指示劑，觀察博來(lái)霉素在肺中的分布。通過(guò)觀察，經(jīng)氣管滴入的伊文斯蘭在肺內(nèi)分布不均，呈塊狀分布，集中在肺內(nèi)個(gè)別區(qū)域，各個(gè)肺葉之間差別明顯，有的全肺葉被染成藍(lán)色，有的肺葉沒(méi)有被染色(圖1 A);經(jīng)霧化的伊文斯蘭在肺內(nèi)分布均勻，在肺葉中呈點(diǎn)狀分布(圖1 B)。

圖1 氣管內(nèi)滴入(A)與氣管內(nèi)霧化(B)伊文斯蘭溶液在肺組織內(nèi)的分布

2.2 實(shí)驗(yàn)鼠生活狀態(tài)的觀察 對(duì)照組大鼠皮毛較光亮，行動(dòng)敏捷、活潑，呼吸平穩(wěn)，正常飲食，體質(zhì)量逐漸增加，無(wú)死亡。模型組大鼠皮毛較暗淡，在給予博來(lái)霉素的前5 d，活動(dòng)較少，反應(yīng)遲鈍，呼吸急促，常伴有咳嗽，在第3 天，模型組出現(xiàn)2 只鼠死亡，第4 天，有1 只死亡，在第5 天后模型組大鼠逐漸恢復(fù)，體質(zhì)量增加，但相對(duì)于對(duì)照組增長(zhǎng)較慢。剩余大鼠隨機(jī)在各時(shí)間點(diǎn)分別處死觀察。

2.3 肉眼觀察肺組織外觀形態(tài)改變 對(duì)照組大鼠雙肺未見(jiàn)明顯病變，呈淡紅色，表面光滑，彈性良好，未見(jiàn)出血點(diǎn)。第7 天時(shí)，肺纖維化模型大鼠肺組織明顯增大，顏色鮮紅，并見(jiàn)肺組織輕度充血，表面出血點(diǎn)增加;第14 天雙肺體積縮小，局部見(jiàn)大小不等結(jié)節(jié)樣改變，仍有陳舊出血點(diǎn)。第21 天和第28 天，模型組表現(xiàn)雙肺體積逐漸縮小，肺組織彈性減弱，顏色變淺，表面可見(jiàn)小片狀、條索狀凹凸不平的蒼白灶。

2.4 組織學(xué)的改變 HE 染色:對(duì)照組未出現(xiàn)病理變化，肺內(nèi)組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔未見(jiàn)增厚，無(wú)炎癥和纖維化表現(xiàn)(圖2A);模型組第7 天肺泡間隔輕度增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)有大量巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，肺內(nèi)結(jié)構(gòu)開(kāi)始紊亂(圖2B);第14 天時(shí)，肺泡炎癥有所減輕，肺泡間隔明顯增厚，開(kāi)始出現(xiàn)纖維化(圖

2.5 羥脯氨酸含量測(cè)定 羥脯氨酸為膠原的特異組成成分，通過(guò)測(cè)定羥脯氨酸的含量可以間接反映組織2C);給藥21 d 和28 d 后纖維化現(xiàn)象嚴(yán)重，纖維細(xì)胞聚集形成纖維灶，彌漫分布在肺組織中(圖2D、E)。

Masson 染色:采用Masson 染色試劑盒可以將組織中的膠原特異性染為藍(lán)色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組在支氣管壁上有較少的膠原，肺泡壁薄，有細(xì)小的膠原散在分布(圖3A);模型組第7 天氣管周圍和增厚的肺泡壁中開(kāi)始有膠原堆積，但沒(méi)有形成片狀(圖3B);第14 天，氣管周圍膠原明顯增多，肺間質(zhì)中膠原有片狀的分布(圖3C);第21 天和28 天時(shí)，肺組織中膠原含量最多，彌漫呈束狀分布在肺間質(zhì)中(圖3D、E)。中膠原的沉積情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各時(shí)間點(diǎn)模型組與對(duì)照組相比羥脯氨酸含量都有所增加，第7 天模型組羥脯氨酸含量與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，第14、21、28 天模型組羥脯氨酸含量與對(duì)照組相比升高顯著(P ＜0.05)。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 IPF 動(dòng)物模型組中羥脯氨酸含量的測(cè)定(±s，μg/g，n=40)

表1 IPF 動(dòng)物模型組中羥脯氨酸含量的測(cè)定(±s，μg/g，n=40)

注:與對(duì)照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別第7 天第14 天第21 天第28天對(duì)照組680.7 ±106.4655.0 ±54.7673.3 ±45.0677.3 ±89.5模型組743.7 ±135.4789.3 ±27.6*1095.0 ±36.2＊＊934.3 ±95.9*

2.6 血?dú)夥治?各時(shí)間點(diǎn)模型組與對(duì)照組相比血氧分壓都有所下降，第7、14、21 天模型組血氧分壓與對(duì)照組相比降低顯著(P ＜0.05)，第28 天模型組血氧分壓與對(duì)照組相比下降差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.251)。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 IPF 動(dòng)物模型組動(dòng)脈血中氧分壓的測(cè)定(±s，mmHg，n=40)

表2 IPF 動(dòng)物模型組動(dòng)脈血中氧分壓的測(cè)定(±s，mmHg，n=40)

注:與對(duì)照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別第7 天第14 天第21 天第28天85.7 ±3.181.7 ±4.286.3 ±2.384.3 ±1.2模型組62.0 ±4.2＊＊63.3 ±11.4*68.7 ±7.5*對(duì)照組69.8 ±20.5

2.7 E-鈣黏素、波形蛋白、α-SMA 蛋白的Western blot 結(jié)果比較 與對(duì)照組相比，第7、14、28 天模型組肺組織中E-鈣黏素的表達(dá)量逐漸降低，成纖維細(xì)胞標(biāo)記波形蛋白的表達(dá)量逐漸升高，肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記α-SMA 的表達(dá)量在第14 天和第28 天模型組中也明顯升高，提示動(dòng)物模型肺纖維化逐漸嚴(yán)重。見(jiàn)圖4。

圖4 IPF 動(dòng)物模型中E-鈣黏素、波形蛋白、α-SMA 在肺組織中的表達(dá)情況

3 討論

3.1 目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用多種方法建立IPF 的動(dòng)物模型［5-6］，博來(lái)霉素致IPF 的動(dòng)物模型雖與人類IPF 有所不同［7］，但因其病理過(guò)程與人類的纖維化過(guò)程很相似［8-9］，所以經(jīng)氣管給予博來(lái)霉素是目前建立IPF 動(dòng)物模型的常用方法。不同劑量的博來(lái)霉素導(dǎo)致大鼠的肺纖維化程度不同，本實(shí)驗(yàn)室在既往研究中發(fā)現(xiàn)，低劑量(3.5 mg/kg)的博來(lái)霉素導(dǎo)致肺纖維化現(xiàn)象不明顯，而高劑量(8 mg/kg)導(dǎo)致大鼠死亡率較高，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的繼續(xù)進(jìn)行，所以本實(shí)驗(yàn)室目前采用較為通用的劑量(5 mg/kg)建造IPF 模型［10］。但使用傳統(tǒng)的氣管滴入灌注造模的方法容易造成動(dòng)物窒息死亡，而且博來(lái)霉素在肺組織內(nèi)分布不均勻，導(dǎo)致病灶不均一，不能準(zhǔn)確地模擬人類IPF 病變的彌漫性分布，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性低，不能滿足實(shí)驗(yàn)需要［4］。本實(shí)驗(yàn)采用美國(guó)PENN-CENTURY公司生產(chǎn)的MicroSprayereTM霧化器，通過(guò)氣管插管實(shí)現(xiàn)了單次霧化給藥造模，降低了實(shí)驗(yàn)鼠的死亡率，并且藥物劑量可以準(zhǔn)確控制，藥物在肺組織內(nèi)均勻分布，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，能夠滿足實(shí)驗(yàn)需要。

3.2 博來(lái)霉素致大鼠的IPF 過(guò)程是隨時(shí)間而演變的，主要分為早期肺組織損傷和水腫，炎癥反應(yīng)及Ⅱ型上皮細(xì)胞增生，隨后間質(zhì)細(xì)胞增生，并最終發(fā)展為彌漫性的纖維化［11］。在本實(shí)驗(yàn)中，肺纖維化模型組在第7 天表現(xiàn)為明顯的炎癥反應(yīng)，肺組織中有大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);第14 天炎癥明顯減輕，并有纖維灶開(kāi)始形成，膠原在氣管周圍開(kāi)始累積;第21 天和第28 天，肺組織中彌漫性地分布有纖維灶和肺大泡，膠原含量明顯增多，并呈束狀分布在肺間質(zhì)中。模型組羥脯氨酸含量逐漸增多，提示在模型組肺組織中膠原逐漸堆積，纖維化逐漸加重。

3.3 IPF 為肺功能限制性通氣障礙，臨床動(dòng)脈血?dú)夥治鰹榈脱跹Y。膠原的異常增生可加重低氧血癥，動(dòng)脈血?dú)夥治鲋醒醴謮旱淖兓欠从撤紊砉δ苤袕浬⒐δ艿闹笜?biāo)之一。采用BD 公司生產(chǎn)的動(dòng)脈采血器，能夠利用負(fù)壓采集到實(shí)驗(yàn)鼠動(dòng)脈血，且采血器內(nèi)自帶適量肝素防止凝血。管體具有高致密性，采血結(jié)束立即將針頭插在絕氣橡膠栓上，能夠減少滲氣，保證采集到血樣的準(zhǔn)確性。在本實(shí)驗(yàn)中，腹主動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示，模型組動(dòng)脈血氧分壓與對(duì)照組相比均有不同程度的降低，提示模型組的肺功能下降，肺纖維化加重。

3.4 在特定的病理?xiàng)l件下，肺間質(zhì)內(nèi)的干細(xì)胞和上皮細(xì)胞等轉(zhuǎn)化為成纖維母細(xì)胞，成纖維母細(xì)胞增殖形成成纖維細(xì)胞灶，該病灶細(xì)胞分泌膠原、纖維蛋白等大量細(xì)胞外基質(zhì)，使肺泡壁增厚，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，導(dǎo)致IPF形成［12］。E-鈣黏素是一種介導(dǎo)細(xì)胞間同質(zhì)黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，主要存在于人和動(dòng)物的上皮細(xì)胞中，參與形成和維護(hù)正常細(xì)胞間的連接，促進(jìn)上皮細(xì)胞間相互黏附，維持組織結(jié)構(gòu)的完整性和上皮極性［13］。研究表明由TGF-β 介導(dǎo)的上皮細(xì)胞分化(epithelialmesenchymal-transition，EMT)中，由于嚴(yán)重的間質(zhì)纖維化和成纖維細(xì)胞的增殖，上皮細(xì)胞的標(biāo)記物E-鈣黏素表達(dá)減少，而間質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞標(biāo)記波形蛋白表達(dá)增加［14］。E-鈣黏素表達(dá)的減少也提示細(xì)胞間黏附減弱，促進(jìn)了成纖維細(xì)胞向損傷部位的遷移。由成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成的肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記α-SMA 逐漸增多［15］，肌成纖維細(xì)胞分泌大量膠原和其他細(xì)胞間基質(zhì)，促進(jìn)了肺纖維化的進(jìn)程，但肺纖維化過(guò)程中更加全面的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)Western bolt 檢測(cè)到，肺纖維化模型組由于肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞，上皮細(xì)胞減少，E-鈣黏素的表達(dá)逐漸下降，各種細(xì)胞間黏附作用減弱;波形蛋白表達(dá)升高，提示間質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞逐漸增多;α-SMA 表達(dá)升高，提示肌成纖維細(xì)胞增生，肺間質(zhì)中膠原和其他細(xì)胞外基質(zhì)得以進(jìn)一步積累，促進(jìn)肺實(shí)變的發(fā)展。

綜上所述，利用美國(guó)PENN-CENTURY 公司生產(chǎn)的MicroSprayereTM霧化器經(jīng)氣道對(duì)大鼠的肺部進(jìn)行霧化給予博來(lái)霉素建立的IPF 模型，與對(duì)照組相比，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺實(shí)變發(fā)生，膠原在肺間質(zhì)中堆積，動(dòng)脈血中氧分壓下降，肺組織中上皮細(xì)胞標(biāo)記減少，成纖維細(xì)胞標(biāo)記增加。這些特點(diǎn)與人類的IPF 的進(jìn)程相似。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用氣道噴霧的方法，相較于氣道滴入的常規(guī)方法，該給藥方式可使藥物在肺組織中分布更為均勻，形成的病灶更加均一。利用此方法建立的動(dòng)物模型可用于IPF 的研究。

［1］ King TE Jr，Pardo A，Selman M. Idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Lancet，2011，378(9807):1949-1961.

［2］ 賴克方，許丹媛. 老年人慢性咳嗽的診治［J］. 實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2011，25(3):187-189.

［3］ Rogliani P，Mura M，Assunta Porretta M，et al. New perspectives in the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Ther Adv Respir Dis，2008，2(2):75-93.

［4］ 李偉峰，胡玉潔，袁偉鋒，等. 氣管內(nèi)滴入與霧化博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較研究［J］. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32(2):221-226.

［5］ Matute-Bello G，F(xiàn)revert CW，Martin TR. Animal models of acute lung injury［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，293(5):L379-L399.

［6］ Moore BB，Hogaboam CM. Murine models of pulmonary fibrosis［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294(2):L152-L160.

［7］ Peng R，Sridhar S，Tyagi G，et al. Bleomycin induces molecular changes directly relevant to idiopathic pulmonary fibrosis:a model for“active”disease［J］. PLoS One，2013，8(4):e59348.

［8］ Moeller A，Ask K，Warburton D，et al. The bleomycin animal model:a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis?［J］. Int J Biochem Cell Biol，2008，40(3):362-382.

［9］ Chung MP，Monick MM，Hamzeh NY，et al. Role of repeated lung injury and genetic background in bleomycin-induced fibrosis［J］. Am J Respir Cell Mol Biol，2003，29(3 Pt 1):375-380.

［10］Guo H，Ji F，Liu B，et al. Peiminine ameliorates bleomycininduced acute lung injury in rats［J］. Mol Med Rep，2013，7(4):1103-1110.

［11］Cavazza A，Rossi G，Carbonelli C，et al. The role of histology in idiopathic pulmonary fibrosis:an update［J］. Respir Med，2010，104(Suppl 1):S11-S22.

［12］ Phan SH. The myofibroblast in pulmonary fibrosis［J］.Chest，2002，122(6 Suppl):286S-289S.

［13］Kim KK，Wei Y，Szekeres C，et al. Epithelial cell alpha3beta1 integrin links beta-catenin and Smad signaling to promote myofibroblast formation and pulmonary fibrosis［J］. J Clin Invest，2009，119(1):213-224.

［14］ Kalluri R，Neilson EG. Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis［J］. J Clin Invest，2003，112(12):1776-1784.

［15］ Yamada M，Kuwano K，Maeyama T，et al. Dual-immunohistochemistry provides little evidence for epithelial-mesenchymal transition in pulmonary fibrosis［J］. Histochem Cell Biol，2008，129(4):453-462.