新藥AD-08對(duì)兩種癡呆動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶障礙和海馬乙酰膽堿酯酶活性的影響

左 亮，原冬冬，張 媛，王 琴，陶 亮

(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東廣州 510080)

阿爾采末病(Alzheimer’s disease，AD)又稱為老年癡呆，是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，在80歲以上的老人中發(fā)病率高達(dá)40%［1－2］。其主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙等神經(jīng)精神癥狀，嚴(yán)重影響患者的社交、職業(yè)與生活功能。AD典型的病理變化包括大腦組織中老年斑的形成，神經(jīng)元纖維纏結(jié)并伴隨膽堿能神經(jīng)元丟失［3］。AD發(fā)生時(shí)腦內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元數(shù)量減少，導(dǎo)致乙酰膽堿含量的下降，該學(xué)說(shuō)是目前較為公認(rèn)的AD的發(fā)病機(jī)制之一［4］，也是AD治療獲得有限療效的重要基礎(chǔ)。迄今為止國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)用于AD治療的藥物不多，代表藥物為膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊，其機(jī)制主要是通過(guò)抑制腦中膽堿酯酶而抑制乙酰膽堿降解，增加局部乙酰膽堿濃度改善神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞功能。但是多奈哌齊的療效維持時(shí)間短;隨著病程的進(jìn)展，當(dāng)功能完整的膽堿能神經(jīng)元漸趨減少時(shí)，多奈哌齊的作用也逐漸減弱。此外，多奈哌齊在臨床上已使用多年，長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性;因此，開(kāi)發(fā)新的能有效治療AD的藥物十分重要。AD-08是我們對(duì)多奈哌齊的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行基團(tuán)改造、合成的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型化合物。前期的實(shí)驗(yàn)證明，AD-08具有脂溶性好，可有效透過(guò)血腦屏障，在腦內(nèi)濃度為血漿中的8倍;并且在體外抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)的效價(jià)是抑制丁酰膽堿酯酶效價(jià)的50倍以上。因此，我們認(rèn)為該化合物具有較好的開(kāi)發(fā)前景，并有可能成為治療AD的新型藥物。本研究在動(dòng)物癡呆模型上，初步研究了AD-08對(duì)癡呆動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用，以及對(duì)大腦海馬組織AChE活性的影響，為AD-08的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 Aβ1-42(貨號(hào)A9810)購(gòu)自Sigma公司;多奈哌齊和AD-08均由國(guó)內(nèi)某知名藥企提供;乙酰膽堿酯酶試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Morris水迷宮測(cè)試系統(tǒng)購(gòu)自淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司;大鼠腦立體定位儀(NARISHIGE SN-3型)購(gòu)自日本成茂公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)biotek公司;微量進(jìn)樣器(規(guī)格5 μl)購(gòu)自上海高鴿工貿(mào)有限公司。

1.2 動(dòng)物與分組 健康成年♂ SD大鼠48只，質(zhì)量(200±20)克，SPF級(jí)，批號(hào) SCXK(粵)2008-0002，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠40只，具有相同遺傳背景的正常對(duì)照小鼠8只，♂(3月齡)，由南京大學(xué)國(guó)家遺傳工程小鼠資源庫(kù)提供，許可證號(hào)SCXK(蘇)2010-0001。兩種動(dòng)物均隨機(jī)分為分成正常組、模型組、陽(yáng)性藥(多奈哌齊)對(duì)照組、AD-08低、中、高劑量組，每組8只。正常組SD大鼠于側(cè)腦室注射生理鹽水5 μl;陽(yáng)性藥對(duì)照組和AD-08各劑量組于側(cè)腦室注射Aβ1-42蛋白5 μl(10 μg)。大鼠術(shù)后灌胃給藥，多奈哌齊和AD-08均用生理鹽水溶解。給藥劑量分別為:多奈哌齊3 mg·kg－1、AD-08 低劑量組0.7 mg·kg－1、中劑量組 3.5 mg·kg－1、高劑量組 7 mg·kg－1，給藥容量為每100 g體質(zhì)量1 ml;每日1次，共給藥8 d。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠養(yǎng)至6月齡，正常對(duì)照組及模型組灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物溶劑(生理鹽水);多奈哌齊組和AD-08各組分別按體重給與相應(yīng)劑量的藥物:多奈哌齊1 mg· kg－1、AD-08低劑量組1 mg·kg－1、中劑量組 5 mg·kg－1、高劑量組 10 mg·kg－1，每天1次，共給藥1個(gè)月。

1.3 Aβ1-42的配制［5］0.1 mg Aβ1-42溶于 50 μl生理鹽水，稀釋為 2 mg·L－1，37℃恒溫箱孵育 5 d，－20℃冰箱保存，切忌反復(fù)凍融。

1.4 癡呆動(dòng)物模型的建立［6］大鼠腹腔注射400 mg·kg－1的水合氯醛麻醉。將麻醉的大鼠固定于大鼠腦立體定位儀上，定位參照George Paxinos和Charles Watson合著的第5版大鼠腦立體定位圖譜，定位方法:前囟向后1.08 mm，中線旁開(kāi)2.5 mm，硬腦膜下3.7 mm。用微量進(jìn)樣器注射，每只大鼠注射5 μl Aβ1-42(2 mg·L－1)，緩慢注射，注完留針10 min以保證其充分彌散，緩慢撤針，縫合消毒。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［7－8］，并作適當(dāng)?shù)匦薷?。?shí)驗(yàn)時(shí)間總共 5 d，以定位航行、空間探索為指標(biāo)。定位航行實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行4 d，觀察和記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間，即潛伏期。最后1 d(d 5)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄動(dòng)物第1次到達(dá)原平臺(tái)位置的時(shí)間、穿越原平臺(tái)的次數(shù)以及在目標(biāo)象限活動(dòng)的時(shí)間百分比。

1.6 AChE活性測(cè)定 Morris水迷宮測(cè)試結(jié)束后，將動(dòng)物斷頭、取出大腦;迅速分離海馬，按所取海馬的重量，加9倍重量的生理鹽水制備腦組織勻漿，3 500 r·min－1離心10 min;取上清液置于 －20℃冰箱保存。根據(jù)南京建成生物工程研究所提供的乙酰膽堿酯酶活性測(cè)試盒的說(shuō)明書測(cè)定乙酰膽堿酯酶活性;用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。

1.7 數(shù)據(jù)的分析與統(tǒng)計(jì) 采用Sigma Plot 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，所有數(shù)值均采用±s表示，分析方法采用Student's t-test。

2 結(jié)果

2.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)Tab 1、2。結(jié)果表明，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物找到平臺(tái)的時(shí)間(即潛伏期)，隨著訓(xùn)練進(jìn)程而逐漸縮短。模型組從訓(xùn)練d 3開(kāi)始，動(dòng)物的潛伏期延長(zhǎng)，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而給予AD-08和多奈哌齊后，SD大鼠和APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的潛伏期均明顯減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Tab 1Effects of AD-08 on escape latency in rats(±s，n=8)

Tab 1Effects of AD-08 on escape latency in rats(±s，n=8)

*P＜0.05 vs AD group

Group Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Control 76.23 ±5.35 54.64 ±6.12 33.16 ±5.46* 24.77 ±3.35*AD 80.33 ±5.59 65.13 ±5.45 64.81 ±5.02 60.28 ±4.25 Donepezil 79.91 ±5.46 52.47 ±5.85 35.49 ±4.45* 21.49 ±4.68*AD-08 0.7 mg·kg－1 74.27 ±5.91 65.92 ±5.28 36.28 ±4.75* 28.67 ±5.19*AD-08 3.5 mg·kg－1 74.11 ±5.81 58.09 ±4.52 31.00 ±4.83* 22.15 ±5.03*AD-08 7 mg·kg－1 80.04 ±5.28 64.31 ±5.21 36.85 ±5.21* 24.29 ±5.12*

Tab 2 Effects of AD-08 on escape latency in APP/PS1 mice(±s，n=8)

Tab 2 Effects of AD-08 on escape latency in APP/PS1 mice(±s，n=8)

*P＜0.05 vs AD group

Group Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Control 53.16 ±5.19 34.23 ±4.15* 32.20 ±4.06* 29.21 ±3.61*AD 67.30 ±7.02 58.21 ±6.58 52.54 ±7.06 51.63 ±6.01 Donepezil 61.12 ±6.12 42.44 ±5.35 39.20 ±6.28* 29.43 ±6.16*AD-08 1 mg·kg－1 60.56 ±5.94 41.82±6.87 31.80±5.29* 24.84±4.30*AD-08 5 mg·kg－1 47.60 ±6.47 53.39±7.46 48.49±8.33 26.12±7.55*AD-08 10 mg·kg－1 54.49 ±6.50 36.34 ±5.31* 30.70 ±4.67* 28.70 ±5.12*

2.2 空間搜索實(shí)驗(yàn) 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)Tab 3、4。結(jié)果顯示:模型組動(dòng)物穿越平臺(tái)位置的次數(shù)，以及在目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間的百分比明顯少于正常組(P＜0.05);而給予AD-08多奈哌齊后，SD大鼠和APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠穿越平臺(tái)位置的次數(shù)增多，在目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間的百分比升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，AD-08能夠明顯的改善癡呆動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

2.3 AChE活性測(cè)定 Tab 5、6的結(jié)果顯示，側(cè)腦室注射Aβ1-42蛋白的癡呆模型大鼠和APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中的AChE活性與正常對(duì)照組相比明顯升高(P＜0.05);給予AD-08和多奈哌齊后，上述模型動(dòng)物海馬組織的AChE活性明顯低于模型組(P＜0.05)。

Tab 3 Results of spatial probe test on rats treated by Aβ1-42(±s，n=8)

Tab 3 Results of spatial probe test on rats treated by Aβ1-42(±s，n=8)

*P＜0.05 vs AD group

Group Crossings of the former platform Percentage of swimming tim in target quadrant/%Control 3.75 ±0.75* 27.80 ±1.87 e*AD 0.88 ±0.30 19.78 ±1.61 Donepezil 3.13 ±0.61* 25.83 ±1.98*AD-08 1 mg·kg－1 3.00 ±0.33* 26.94 ±2.11*AD-08 5 mg·kg－1 3.88 ±0.35* 25.72 ±1.29*AD-08 10 mg·kg－1 3.13 ±0.44* 26.61 ±1.64*

Tab 4Results of spatial probe test on APP/PS1 mice(±s，n=8)

Tab 4Results of spatial probe test on APP/PS1 mice(±s，n=8)

*P＜0.05 vs AD group

Group Crossings of the former platform Percentage of swimming tim in target quadrant/%Control 3.56 ±0.65* 28.25 ±3.54 e*AD 1.09 ±0.25 18.86 ±1.84 Donepezil 3.64 ±0.62* 29.07 ±1.22*AD-08 1 mg·kg－1 2.83 ±0.42* 26.26 ±1.44*AD-08 5 mg·kg－1 3.50 ±0.67* 30.76 ±3.33*AD-08 10 mg·kg－1 3.08 ±0.55* 27.69 ±5.30*

Tab 5 Effect of AD-08 on acetylcholinesterase activity in rats(±s，n=8)

Tab 5 Effect of AD-08 on acetylcholinesterase activity in rats(±s，n=8)

*P＜0.05 vs AD group

Group AChE activity Control 0.33 ±0.04*AD 0.66 ±0.07 Donepezil 0.34 ±0.04*AD-08 0.7 mg·kg－1 0.32 ±0.06*AD-08 3.5 mg·kg－1 0.30 ±0.02*AD-08 7 mg·kg－1 0.31 ±0.05*

Tab 6 Effects of AD-08 on acetylcholinesterase activity in APP/PS1 mice(±s，n=8)

Tab 6 Effects of AD-08 on acetylcholinesterase activity in APP/PS1 mice(±s，n=8)

*P＜0.05 vs AD group

Group AChE activity Control 0.23 ±0.02*AD 0.54 ±0.05 Donepezil 0.31 ±0.05*AD-08 1 mg·kg－1 0.27 ±0.03*AD-08 5 mg·kg－1 0.31 ±0.05*AD-08 10 mg·kg－1 0.31 ±0.03*

3 討論

由于AD的發(fā)病機(jī)制至今尚未被闡明，目前還沒(méi)有能夠通過(guò)制止神經(jīng)元退行性病變來(lái)治療AD的藥物;現(xiàn)在臨床上應(yīng)用的抗AD藥物主要有膽堿酯酶抑制劑(如多奈哌齊、石杉?jí)A甲、利斯的明)、谷氨酸受體拮抗劑(如美金剛)以及改善腦循環(huán)和腦代謝的藥物(如尼莫地平、腦復(fù)新等)。本研究在不同癡呆動(dòng)物模型上評(píng)價(jià)了新型化合物AD-08對(duì)癡呆動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的影響。我們的研究結(jié)果表明，AD-08能夠明顯改善癡呆模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，其作用與多奈哌齊相似;同時(shí)發(fā)現(xiàn)，AD-08的作用機(jī)制可能與抑制乙酰膽堿酯酶的活性有關(guān)。

AD典型的病理變化包括老年斑的形成，神經(jīng)元纖維纏結(jié)并伴隨膽堿能神經(jīng)元的丟失［9］。Aβ淀粉樣蛋白是老年斑的主要成分之一。沉積的Aβ蛋白對(duì)神經(jīng)元有毒性作用，可損害膽堿能神經(jīng)元而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降。我們采用的側(cè)腦室注射Aβ蛋白的方法是目前臨床前藥效學(xué)評(píng)價(jià)的經(jīng)典模型［10］。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠是在APP蛋白的第670位和671位的氨基酸發(fā)生雙突變以及PS1基因的第9個(gè)外顯子敲除后得到的AD模型;通過(guò)基因突變和敲除，導(dǎo)致Aβ產(chǎn)生增多，能夠模擬AD患者的大部分的病理特征，是一種評(píng)價(jià)AD治療藥物療效的可靠模型［11］。研究表明［12］，Aβ 蛋白沉積可造成膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性降低，引起Aβ沉積周圍的膽堿能神經(jīng)元減少，進(jìn)而導(dǎo)致記憶損傷。Aβ也可作用于膽堿能神經(jīng)元末梢，通過(guò)抑制膽堿的攝取而減少乙酰膽堿合成，從而使大腦海馬和皮質(zhì)釋放的乙酰膽堿減少。此外，Aβ可降低丙酮酸脫氫酶的活性，減少葡萄糖和糖原攝取，加速膽堿能神經(jīng)元變性。葡萄糖代謝降低還使乙酰輔酶A生成減少，使乙酰膽堿合成受阻，進(jìn)而導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元功能減退甚至死亡。因此，能夠增強(qiáng)大腦膽堿能神經(jīng)功能的藥物可以改善Aβ沉積引起的學(xué)習(xí)記憶障礙［13］。

AD-08是經(jīng)過(guò)篩選得到的一種具有較好開(kāi)發(fā)價(jià)值的新型化合物;它是根據(jù)多奈哌齊的化學(xué)結(jié)構(gòu)改造合成的。在篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，該化合物脂溶性好，生物利用度高，并且能有效透過(guò)血腦屏障，在體外對(duì)乙酰膽堿酯酶具較高的選擇性。其不良反應(yīng)少，長(zhǎng)期使用對(duì)肝臟影響小，這些優(yōu)點(diǎn)使其有可能成為治療AD的新型藥物，具有重要的研究?jī)r(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，在兩種癡呆動(dòng)物模型，3個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量的AD-08均能改善癡呆動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能，并能明顯降低模型組腦組織中AChE的活性;AD-08的上述作用與相同劑量的多奈哌齊相似。本研究的結(jié)果提示，AD-08對(duì)Aβ蛋白沉積引起的癡呆動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用可能是通過(guò)抑制大腦AChE活性，增強(qiáng)膽堿神經(jīng)元功能產(chǎn)生的。

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