氣相色譜法測定雞精中2種氯丙醇的方法研究

黃 琦，季曉娟，王丹丹

（1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州310023；2.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州310004）

氯丙醇是國際公認(rèn)的食品污染物，氯丙醇的污染主要來源于酸水解植物蛋白（HVP），而HVP被廣泛應(yīng)用于各種調(diào)味品。蛋白水解物中氯丙醇的種類有：3－氯－1，2－丙二醇（3－MCPD）、2－氯－1，3－丙二醇（2－MCPD）、1，3－二氯－2－丙醇（1，3－DCP）和2，3－二氯－1－丙醇（2，3－DCP）。其中3－MCPD和1，3－DCP是主要檢測的對象。毒理學(xué)研究表明3－MCPD有致癌性、遺傳毒性、生殖毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒性等，是氯丙醇中的主要成分［1］。WHO/FAO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)（JECFA）提出，3－MCPD的暫定每日最大耐受攝入量（PMTDI）為2μg（以每千克體質(zhì)量計(jì)），認(rèn)為1，3－DCP為遺傳毒性致癌物，目前不宜制訂每日耐受量（TDI）［2］。許多國家已經(jīng)制訂了HVP和醬油中3－MCPD的限量標(biāo)準(zhǔn)，歐盟要求HVP和醬油中的3－MCPD低于20μg/kg，德國和澳大利亞規(guī)定1，3－DCP應(yīng)低于50μg/kg［3］。目前，對氯丙醇的研究主要集中在日常生活中用到的醬油［4－6］，而雞精作為常用調(diào)味品之一報(bào)道較少。氯丙醇定量的主要方法是氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法，該法靈敏度高，專屬性好，但是需要采用同位素內(nèi)標(biāo)定量，操作繁瑣，成本較高，而且儀器價(jià)格昂貴，難以普及。本試驗(yàn)采用基質(zhì)固相分散萃取法（MSPD）提取、凈化樣品，用七氟丁?；溥颍℉FBI）衍生化，建立氣相色譜－電子捕獲檢測器（GC－ECD）測定雞精中3－MCPD和1，3－DCP的方法。實(shí)驗(yàn)表明，該方法簡便易行，靈敏度高，結(jié)果令人滿意，具有較強(qiáng)的實(shí)用性。

1 材料與儀器

3－MCPD和1，3－DCP（純度≥99.0%）：德國 Merck公司，HFBI：美國Pierce公司；ExtrelutTM20硅藻土填料：德國Merck公司；正己烷（色譜純）：美國Sigma公司；乙醚為分析純，重蒸后使用；氯化鈉和無水硫酸鈉為分析純，經(jīng)過600℃灼燒4h后得到；水為超純水；雞精購于本地超市；除非另有說明，實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

島津GC－14C型氣相色譜儀配電子捕獲檢測器（ECD）：日本島津公司，色譜柱：J＆WDB－5（30m×0.32mm×0.25μm），玻璃層析柱（40cm×2cm），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，氮?dú)庹舭l(fā)器，恒溫箱，渦漩混合器，1mL氣密針。

2 試驗(yàn)部分

2.1 樣品的提取、凈化

稱取試樣2.00g，置100mL燒杯中，加飽和氯化鈉溶液（稱取氯化鈉290g，加水溶解并稀釋至1 000mL）6g，超聲15min。加入5g ExtrelutTM20硅藻土柱填料，攪拌均勻后，裝入已依次充填1cm高的無水硫酸鈉和5g ExtrelutTM20的玻璃層析柱中，壓實(shí)，再填入1cm高的無水硫酸鈉，放置15min后，用正己烷洗脫去除脂溶性雜質(zhì)，并棄去。用乙醚140mL洗脫，流速約5mL/min，收集乙醚洗脫液。在收集的乙醚洗脫液中加無水硫酸鈉15g，振搖，放置10min后，過濾，濾液于40℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約0.5mL（切勿蒸干），轉(zhuǎn)移至約5mL具塞試管中，用正己烷洗滌旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，合并洗滌液至試管中，并用正己烷稀釋至刻度。

2.2 衍生化

將上述試樣提取液在室溫下用氮?dú)鉂饪s至2.0mL，用氣密針迅速加入HFBI 50μL，立即密塞。渦旋充分混合后，于75℃下保溫30min。取出后，放置至室溫，加飽和氯化鈉溶液3mL；渦旋混合0.5min，靜置使兩相分離。取上層正己烷加無水硫酸鈉約0.3g干燥，靜置5min，供氣相色譜分析測定［3］。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

分別準(zhǔn)確稱取3－MCPD和1，3－DCP標(biāo)準(zhǔn)品25mg（有效成分），分別置于2個(gè)25mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，得質(zhì)量濃度為1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用正己烷稀釋10倍，配制100mg/L中間溶液，最后用正己烷配成質(zhì)量濃度為0.10、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列各0.2mL，用正己烷定容至2.0mL，用氣密針迅速加入HFBI 50μL，立即密塞，振勻。接下來的步驟與樣品的衍生化方法相同，得到質(zhì)量濃度范圍在0.010～0.250mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列HFBI衍生物溶液。

2.4 氣相色譜條件

DB－5石英毛細(xì)管柱，30m×0.32mm×0.25μm；進(jìn)樣口溫度為240℃，檢測器溫度為280℃；色譜柱溫度初溫為60℃，保持1min，以4℃/min升至100℃，保持1min，再以30℃/min升至250℃，并保持5min；載氣為高純氮?dú)?，流速?.0mL/min；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0μL；峰面積外標(biāo)法定量。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品提取凈化條件的選擇

樣品純化時(shí)，需要清除基質(zhì)中的色素、脂肪和蛋白質(zhì)，而氯丙醇在極性溶劑和非極性溶劑中都有良好的溶解性，所以液液提取方法很難有效進(jìn)行，必須采用固相提取技術(shù)［7］。試驗(yàn)考察了氧化鋁、硅膠、ExtrelutTM20硅藻土3種吸附劑對樣品的吸附作用，結(jié)果表明，ExtrelutTM20硅藻土效果最佳，其穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好，具有很好的吸水性。裝柱時(shí)比較了2種方式：一是常規(guī)方式用ExtrelutTM20硅藻土裝柱；二是把該ExtrelutTM20硅藻土一半先裝柱，另一半與樣品混合均勻后再裝柱。試驗(yàn)結(jié)果表明，后者更加有利于提取操作。

采用有機(jī)溶劑預(yù)洗脫去除樣品中的脂溶性雜質(zhì)和色素等，可減少衍生時(shí)的干擾及對色譜柱進(jìn)樣口的污染。試驗(yàn)表明，僅測定3－MCPD時(shí)可用正己烷－乙醚（體積比9∶1）洗脫去除脂溶性雜質(zhì)，但是1，3－DCP有較大的損失（≥30%），采用正己烷預(yù)洗脫即可避免損失。

洗脫氯丙醇常用乙醚或乙酸乙酯［7］。通過試驗(yàn)比較了這2種洗脫溶劑，回收率如表1所示。結(jié)果表明，采用乙酸乙酯洗脫，用量較大，且雜峰太多，而采用乙醚洗脫，效果較好。采用140mL乙醚洗脫，回收率可達(dá)98.2%以上。洗脫液含有水分會(huì)影響后續(xù)的衍生化，采用無水硫酸鈉干燥，效果較好，而采用硫酸鎂、硫酸鈣、氧化鈣等干燥會(huì)引起較大的損失。

表1 2種洗脫溶劑的回收率（n＝6）Table 1 Recoveries of 2elution solvents（n＝6）

3.2 衍生化方法的選擇

3.2.1 衍生化試劑的選擇

氯丙醇的極性較大、蒸氣壓低、沸點(diǎn)較高，衍生化后可以提高分析物的揮發(fā)性及檢測的靈敏度?？晒┦褂玫难苌噭┯衅叻□Ｔ噭?（HFBI、HFBA）、硼酸類（丁基硼酸、苯基硼酸）、丙酮或庚酮、三氟乙酸酐（TFAA）、N，O－雙三甲基－三氟乙酰胺（BSTFA）等試劑。硼酸類、丙酮只能衍生3－MCPD等雙羥基醇類化合物；TFAA比HFBI的衍生反應(yīng)容易進(jìn)行，但產(chǎn)生的有機(jī)酸可能會(huì)分解氯丙醇衍生物，且靈敏度不如HFBI衍生物高；七氟丁酸酐（HFBA）雖然在室溫下就可以反應(yīng)，但是副產(chǎn)物七氟丁酸可能會(huì)降解氯丙醇衍生物；BSTFA主要用于氫火焰離子化檢測器（FID）［8］。相比之下，采用HFBI衍生后氯丙醇的電負(fù)性明顯增強(qiáng)，且HFBI衍生的化合物比較穩(wěn)定、檢測靈敏度較高。

3.2.2 衍生化條件的選擇

分別選擇60、70、80、90℃等不同的衍生化溫度，該衍生化反應(yīng)在70～80℃效果最佳，最終選擇75℃為衍生化溫度；在該溫度下分別衍生20、30、40、50min，結(jié)果表明，衍生時(shí)間大于30min后，峰面積增加不明顯，因此選擇反應(yīng)時(shí)間30min。在選定的衍生化時(shí)間及溫度下，分別加入40、50、60、70μL的衍生化試劑，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)50μL的HFBI已完全滿足要求。由于HFBI遇水迅速反應(yīng)，因此環(huán)境的濕度影響極大，使用過程中需注意防潮。在相對濕度超過70%時(shí)，需用氣密針迅速加入衍生化試劑。衍生后加入飽和氯化鈉或蒸餾水除去過量衍生劑、副產(chǎn)物。

3.3 色譜條件的選擇

衍生化后的氯丙醇可用非極性柱或弱極性柱分析。比較了實(shí)驗(yàn)室的2種色譜柱DB－1色譜柱（30m×0.32mm×0.25μm）和DB－5色譜柱（30m×0.32mm×0.25μm），均能滿足分析要求；但是采用DB－5柱分析，峰形好，出峰快，因此選用DB－5色譜柱。為使雜質(zhì)峰和主峰獲得較好的分離效果和合適的保留時(shí)間，必須采用程序升溫方式。經(jīng)多次試驗(yàn)，所選條件同2.4。在該色譜條件下，3－MCPD和1，3－DCP的保留時(shí)間分別為約7.23min和11.85min。衍生化后的3－MCPD和1，3－DCP標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1，含氯丙醇的雞精樣品色譜圖見圖2。

圖1 3－MCPD和1，3－DCP標(biāo)準(zhǔn)HFBI衍生物氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of HFBI derivatives of 3－MCPD and 1，3－DCP standards

圖2 雞精樣品中3－MCPD和1，3－DCP的HFBI衍生物氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of HFBI derivatives of 3－MCPD and 1，3－DCP in chicken essence

3.4 線性關(guān)系及檢測限

分別取混合標(biāo)準(zhǔn)系列HFBI衍生物溶液1.0μL進(jìn)樣測定。分別以3－MCPD和1，3－DCP的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3－MCPD的回歸方程為：Y＝1 136 457X－412.62，相關(guān)系數(shù)為0.999 1；1，3－DCP的回歸方程為：Y＝138 739X－337.15，相關(guān)系數(shù)為0.999 3。結(jié)果表明，2種氯丙醇在0.010～0.250mg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。經(jīng)多次試驗(yàn)，該方法測定3－MCPD和1，3－DCP的定量限均為0.01mg/kg，能滿足檢測和定量分析的要求。以3倍基線噪音計(jì)算，方法的檢測限均為0.005mg/kg。

3.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)和方法精密度

取3－MCPD和1，3－DCP空白的雞精樣品作為基質(zhì)，分別測定0.05、0.10和0.20mg/kg 3種添標(biāo)水平下3－MCPD和1，3－DCP的加標(biāo)回收率，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。每個(gè)水平測定6次，回收率及精密度結(jié)果見表2。結(jié)果表明，3－MCPD的回收率在95.7%～102.2%范圍內(nèi)；1，3－DCP的回收率在94.5%～99.3%范圍內(nèi)，兩者相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0%。該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，符合氯丙醇污染測定的技術(shù)要求。

表2 方法的回收率和精密度（n＝6）Table 2 Recovery and precision of method（n＝6）

3.6 雞精樣品檢測

采用建立的試驗(yàn)方法對市場上12種品牌（每種品牌10批），共120份雞精產(chǎn)品進(jìn)行測定，共有4個(gè)品牌的21份雞精樣品中檢出3－MCPD，檢出率為17.5%，其中4份質(zhì)量濃度超過20μg/kg；有3個(gè)品牌13份雞精樣品中檢出1，3－DCP，檢出率為10.8%，質(zhì)量濃度均未超過20μg/kg。

4 結(jié) 語

本試驗(yàn)所建立的方法能同時(shí)測定雞精中3－MCPD和1，3－DCP的質(zhì)量濃度，方法靈敏度較高，回收率較高，相對偏差較小，可以準(zhǔn)確地測定雞精中2種氯丙醇的質(zhì)量濃度；方法定量限0.01mg/kg，能滿足雞精中2種氯丙醇限量檢測的要求；試驗(yàn)所用儀器易于普及，便于推廣應(yīng)用，是一種較理想的分析方法。本方法也適用于其他調(diào)味品和存在氯丙醇污染的食品中3－MCPD和1，3－DCP的限量測定。

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