B 型鈉尿肽在大鼠心肌纖維化中的變化及卡維地洛的干預(yù)作用

鄭 崢，趙艷男，路 明

心肌纖維化(myocardial fibrosis)是充血性心力衰竭的病理學(xué)基礎(chǔ)，近年來人們逐漸認(rèn)識到，心肌纖維化在心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展中起十分重要的作用［1］。血液中B 型鈉尿肽(BNP)現(xiàn)已作為心力衰竭的診斷和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)［2］，但BNP，特別是心肌組織中的BNP 表達(dá)與心肌纖維化的關(guān)系報(bào)道尚少，本研究通過異丙基腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)的慢性心肌纖維化大鼠模型進(jìn)行初步研究，并探討第三代非選擇性β －受體阻斷劑卡維地洛通過抑制心肌纖維對血漿BNP 水平和心肌BNP mRNA 表達(dá)的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 一般材料 雄性Sprague Dawley (SD)大鼠46 只，體質(zhì)量100 ～150g，由徐州醫(yī)學(xué)院動物中心提供;ISO 注射液(上海和豐制藥有限公司);卡維地洛片劑(北京巨能制藥有限責(zé)任公司);大鼠BNP ELISA 試劑盒(產(chǎn)品編號E02B0452，藍(lán)基生物制品有限公司);Trzol 提取液及RT －PCR 兩步法試劑盒(北京天根生物工程有限公司);引物(上海生工生物工程有限公司);Thermo Scientific Multiskan Spectrum 酶標(biāo)儀;PCR儀;紫外線成像分析系統(tǒng);CISA－1000 計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)。

1.2 動物分組及給藥 將46 只健康雄性SD 大鼠隨機(jī)分為4周模型組(n=10)、8 周模型組(n =9)、卡維地洛組(n =11)，4 周對照組(n=8)和8 周對照組(n =8)。4 周模型組、8 周模型組、卡維地洛組參考Rona 等的方法［3］，以10mg·kg－1·d－1劑量皮下多點(diǎn)注射ISO，連續(xù)治療7d，4 周及8 周對照組給予皮下0.9%氯化鈉溶液替代ISO。至4 周心肌纖維化模型形成，4 周模型組大鼠死亡1 只，卡維地洛組大鼠死亡2 只，將4 周模型組剩余者和4 周對照組大鼠處死?？ňS地洛組開始給予卡維地洛10mg·kg－1·d－1灌胃，每周測1 次體質(zhì)量調(diào)整劑量，共4 周。8 周模型組和8 周對照組同時(shí)給予等量蒸餾水灌胃。至8 周時(shí)8 周模型組死亡1 只，卡維地洛組和8周對照組全部存活，處死所有存活大鼠。

1.3 血液及組織標(biāo)本的留取 動物處死前稱重 (BW)，0.3%水合氯醛腹腔注射麻醉下心臟采血3ml，然后將動物處死，完整切取心臟，冰鹽水沖洗。稱量心臟質(zhì)量(HW)，計(jì)算心重指數(shù)(HWI =HW/BW)。切取部分左室心肌用10%甲醛固定，剩余左心室組織置－80℃冰箱保存待測。

1.4 心肌組織學(xué)觀察、膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)的測定 心肌組織置于4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片經(jīng)MASSON 染色，用CISA－1000 計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。在MASSON 染色切片上每鼠隨機(jī)取6 個(gè)視野，采用測量CVF。

1.5 血清BNP 的檢測

1.5.1 血清采集 將抽取的血液標(biāo)本注入無抗凝劑的真空采血管中混勻，迅速4℃離心20min (轉(zhuǎn)速1000r/min)，取上層血清，置－80℃冰箱保存。測定時(shí)，將標(biāo)本置室溫復(fù)融混勻，同上離心5min，取上清液。

1.5.2 BNP 測定 采用競爭性抑制法酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，加入待測樣本和酶聯(lián)親和物共同競爭包被在微孔板上抗體的定量結(jié)合位點(diǎn)。反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的部分，再加入底物反應(yīng)，底物在酶的作用下變?yōu)樗{(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。通過測定吸光度來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算出待測樣本的濃度。結(jié)果單位為pg/ml，最小可測值為1.0pg/ml。

1.6 RT－PCR 法檢測心肌組織BNP mRNA 的表達(dá)

1.6.1 總RNA 的提取 取50 ～100mg 大鼠心肌組織，用TRizol 試劑一步法提取總RNA，溶解于35μl RNase － free ddH2O中，測定濃度后保存于－80℃。

1.6.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(reverse transcription，RT)兩步法 RNA 5μl，Oligo (dT)15 (天根生物工程有限公司)2μl、超純Dntp (2.5mMeach)(天根生物工程有限公司)2μl、補(bǔ)RNase－free ddH2O 定容至14.5μl 70℃加熱5min 后迅速冰上冷卻2min。簡單離心收集反應(yīng)液后加入5 ×First －Strand Buffer (含DTT)(天根生物工程有限公司)4μl、0.5μl RNasin、TIANScript M－MLV (天根生物工程有限公司)1μl (200U)，42℃溫浴50min，95℃加熱5min 終止反應(yīng)。

1.6.3 PCR 反應(yīng) cDNA 2.5μl、2 ×Master MIX 12.5μl (天根生物工程有限公司)，BNP 上游引物5' －cctgcttttccttaatctgtcg －3'和下游引物5' － gcttgaactatgtgccatcttg －3'各1μl，GAPDH 上游引物5' －CCAAAAGGGTCATCATCTCC －3'和下游引物5' －CAACCTGGTCCTCAGTGTAGC － 3' 各1μl，補(bǔ)RNase － Free ddH2O 至25μl 體積。PCR 反應(yīng)條件為:BNP 預(yù)變性94℃5min，變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，循環(huán)34次后72℃延伸7min。GAPDH 的反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃5min，變性94℃30s，退火60℃30s，延伸72℃30s，循環(huán)34 次后72℃延伸7min。

1.6.4 瓊脂糖電泳 PCR 產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，BNP 259bp，GAPDH 498pb。在紫外燈下照相，用圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，做掃描面積積分半定量分析，以GAPDH 作為內(nèi)參照，比較各組BNP/GAPDH 比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以(± s)表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，相關(guān)性采用直線相關(guān)分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ISO 誘導(dǎo)的心肌纖維化大鼠模型 注射ISO 后大鼠開始出現(xiàn)食欲不振、倦怠少動、體質(zhì)量增長緩慢、呼吸困難等表現(xiàn)，至4 周時(shí)，光鏡下觀察右心室心肌切片MASSON 染色示心肌細(xì)胞有明顯的排列紊亂，并出現(xiàn)心肌纖維的斷裂、分叉，部分肌質(zhì)溶解，出現(xiàn)空泡;而正常對照組心肌細(xì)胞排列整齊，可見細(xì)胞間隙。至8 周時(shí)，心肌纖維化更為明顯，心肌纖維雜亂無章，大量斷裂肌纖維分布于視野中。卡維地洛組雖心肌細(xì)胞也有排列紊亂、肌纖維斷裂現(xiàn)象，但較8 周模型組相比視野中的不規(guī)則肌纖維范圍稍小(見圖1)。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)觀察結(jié)果(MASSON 染色，×400)Figure 1 Result of pathological myocardial tissue each rats group

2.2 大鼠CVF、HWI、血清BNP、心肌組織BNP mRNA 的變化 (1)和4 周對照組比較，4 周模型組大鼠HWI 和CVF、血清BNP、心肌組織BNP mRNA 值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。(2)8 周對照組和8 周模型組大鼠HWI 和CVF、血清BNP、心肌組織BNP mRNA 值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。(3)8 周模型組與4 周模型組大鼠HWI 和CVF、血清BNP、心肌組織BNP mRNA 值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01，見表1、圖2)。

2.3 卡維地洛干預(yù)作用 心肌纖維化后連續(xù)用藥4 周的卡維地洛組和8 周模型組大鼠CVF 和HWI、血清BNP 和心肌BNP mRNA 表達(dá)值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01，見表1、圖2)。

2.4 相關(guān)性分析 模型組大鼠血清BNP 和BNP mRNA 表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.647 ，P ＜0.01，見圖3)。

表1 各組大鼠HWI、CVF、血清BNP 和心肌BNP mRNA 表達(dá)值的比較(±s)Table 1 Comparison of HWI，CVF，serum BNP and myocardial BNP mRNA expression value each rat group

表1 各組大鼠HWI、CVF、血清BNP 和心肌BNP mRNA 表達(dá)值的比較(±s)Table 1 Comparison of HWI，CVF，serum BNP and myocardial BNP mRNA expression value each rat group

組別 只數(shù) HWI CVF(%) 血清BNP(ng/L)心肌BNP mRNA 4 周對照組8 3.12±0.11 2.75±0.25 160.2±29.5 0.39±0.05 4 周模型組 9 4.30±0.07 12.83±0.21 411.8±65.6 0.87±0.06 8 周對照組 8 3.48±0.15 2.89±0.24 180.7±25.2 0.52±0.04 8 周模型組 8 5.23±0.07 18.66±0.32 637.0±76.6 1.25±0.28卡維地洛組9 4.57±0.48 15.31±0.24 473.2±53.3 0.87±0.03

圖2 5 組心肌BNP mRNA 的表達(dá)Figure 2 The expression of myocardial BNP mRNA in 5 groups

圖3 模型組大鼠血清BNP、心肌BNP mRNA 灰度值的相關(guān)性Figure 3 The correlation between the model group rats serum BNP，myocardial BNP mRNA gray value

3 討論

心肌纖維化是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，是心肌重塑的主要表現(xiàn)，是心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展重要的病理學(xué)基礎(chǔ)，心肌細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維過量積聚、膠原濃度明顯升高或膠原容積分?jǐn)?shù)明顯高于正常為其主要特征［4］。現(xiàn)在的研究認(rèn)為，除腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)的作用外，交感－腎上腺素能系統(tǒng)在導(dǎo)致心肌纖維化的神經(jīng)內(nèi)分泌因素中也占有重要地位，給大鼠長期注射β－受體激動劑可導(dǎo)致導(dǎo)致大鼠左室質(zhì)量增加、左室蛋白含量及β－重鏈肌球蛋白水平提高、左室肥厚和心肌纖維化［5］。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Rona 等人方法略作修改，給予雄性SD 大鼠皮下注射ISO 10mg/kg，連續(xù)7d，4周后通過對大鼠心肌組織學(xué)觀察、測CVF 增加證實(shí)膠原的增生，表明模型心肌纖維化成功。

BNP 是1988 年日本學(xué)者Sudoh 首先從豬腦中分離出來的，屬利鈉多肽系統(tǒng)。心臟中BNP 的水平最高，其合成分泌的主要部位是心室［6］。BNP 是在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境水鹽平衡、血壓穩(wěn)定、調(diào)節(jié)心血管功能中具有重要意義的一種多肽。有研究表明，其增高程度和心力衰竭的嚴(yán)重程度相關(guān)。正常情況下心室中存在低水平的BNP mRNA，表達(dá)的BNP 前體也直接進(jìn)入血液分解成了具有生物學(xué)活性的BNP，而在急性心肌損傷時(shí)，心室的BNP mRNA 水平會明顯提高［7］。本研究結(jié)果顯示ISO 注射4 周后模型組大鼠心肌發(fā)生了纖維化，BNP 水平和BNP mRNA 的表達(dá)均明顯高于4 周對照組，血清BNP 水平與心肌BNP mRNA 呈正相關(guān)，表明血清BNP 可以反映心肌BNP mRNA 表達(dá)水平，而8 周組BNP 水平及其mRNA 的表達(dá)增高更為明顯，也進(jìn)一步說明在心肌纖維化的發(fā)展過程中，機(jī)體合成和分泌BNP 的能力是在持續(xù)增加的，這可能是心肌細(xì)胞應(yīng)對損傷導(dǎo)致心肌纖維化的重要代償機(jī)制。

卡維地洛是一種新一代非選擇性β－受體阻滯劑，能改善心力衰竭患者心室功能、增加心臟指數(shù)、降低心縮力、減少心臟做功和心肌耗氧量。治療心力衰竭患者也可使BNP 水平降低，用卡維地洛治療腎動脈結(jié)扎導(dǎo)致的大鼠心肌肥厚，可逆轉(zhuǎn)升高的BNP 蛋白和其mRNA 表達(dá)［8］。在本研究中，卡維地洛使心肌纖維化的病理學(xué)表現(xiàn)有所緩解的同時(shí)，也明顯降低了心肌纖維化大鼠升高的血清BNP 水平，表明卡維地洛的治療作用可能也對BNP 產(chǎn)生了影響。BNP 作為心臟疾病特別是心肌纖維化的早期診斷、分級及轉(zhuǎn)歸的指示劑具有廣泛的發(fā)展前景。關(guān)于BNP 在心肌纖維化中的作用及變化機(jī)制的進(jìn)一步研究，可能為今后治療心肌纖維化及其心力衰竭提供新的思路。

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