IL-23/IL-17炎癥軸在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎中的作用

李曉妮 鄧志華* 賀 靜 王 琪

（山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，山西 太原 030001）

IL-23/IL-17炎癥軸在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎中的作用

李曉妮 鄧志華* 賀 靜 王 琪

（山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，山西 太原 030001）

目的 通過建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎小鼠模型，觀察外源性IL-23對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎模型小鼠中IL-17的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法 以肝抗原S-100免疫C57BL/6小鼠制作自身免疫性肝炎動物模型，提取出脾淋巴細(xì)胞，將IL-23加入到抗CD3抗體活化后的脾淋巴細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，免疫組化觀察IL-17在肝細(xì)胞中的分布及表達(dá)水平，RT-PCR和ELISA檢測IL-17在脾淋巴細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果 與對照組相比，模型組肝細(xì)胞中IL-17表達(dá)升高；IL-23作用于模型組活化的脾淋巴細(xì)胞后IL-17的表達(dá)水平明顯高于對照組。結(jié)論IL-23/IL-17炎癥軸在EAH的病理機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，IL-23可能通過上調(diào)IL-17的表達(dá)使AIH模型小鼠癥狀加重，并為AIH的治療提供了新的靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎；白細(xì)胞介素17；白細(xì)胞介素23

自身免疫性肝炎（AIH）是一種慢性進(jìn)行性肝臟炎癥性疾病，以匯管區(qū)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤，并侵入肝臟實(shí)質(zhì)，形成界面下肝炎的肝臟特異性組織學(xué)改變、高免疫球蛋白、循環(huán)自身抗體及對免疫抑制劑治療有所反應(yīng)為其主要特征[1,2]，主要累及中老年婦女。近年來，國內(nèi)外對AIH的研究十分活躍，其發(fā)病機(jī)制還尚未完全闡明。

Th17細(xì)胞為近年來新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞型，它通過分泌IL-17A（即IL-17）、IL-17F和TNF-α等因子而在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的作用[3]。IL-17A作為IL-17家族的代表性因子，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在多種自身免疫性疾病中均有不同程度的升高。有學(xué)者在研究原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）發(fā)病過程中膽管的固有免疫作用時發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞相關(guān)的主要細(xì)胞因子IL-17在PBC患者膽管的慢性炎癥中發(fā)揮重要作用[4]。同時，也有研究發(fā)現(xiàn)PBC患者肝臟匯管區(qū)IL-17表達(dá)明顯增多[5]。國外報道體外誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化產(chǎn)生IL-17與多種細(xì)胞因子密切相關(guān)，其中IL-23在誘導(dǎo)其分化過程中起到十分關(guān)鍵的作用[6]。IL-23作為IL-12家族的新成員，在一些炎癥性自身免疫性疾病模型的形成和發(fā)展中起著十分重要的作用，如炎癥性腸?。↖BD）、自身免疫性腦脊髓膜炎（EAE）、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA）、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）[7-11]。同時，也有實(shí)驗(yàn)證明在這些疾病模型中IL-23可促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化、增殖，進(jìn)一步促進(jìn)IL-17的分泌[12]，這些結(jié)果說明了IL-23/IL-17通路在一些自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著一定的作用，但I(xiàn)L-23/IL-17在AIH疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制仍不清楚。為此，本研究建立EAH模型，旨在通過觀察IL-23對自身免疫性肝炎小鼠模型IL-17水平的影響，為揭示IL-17/IL-23炎癥軸在EAH發(fā)病機(jī)制中所起的作用提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1640培養(yǎng)基（美國HyClone公司），兔抗小鼠IL-17A、羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司），小鼠臟器組織淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司），小鼠白細(xì)胞介素-17ELISA試劑盒（武漢博士得生物工程有限公司），IL-23 小鼠CD3單抗（美國eBiosicience公司），F(xiàn)ITC-標(biāo)記羊抗小鼠IgG（H+L）（美國Earthax公司），佛氏完全佐劑（美國sigma公司），F(xiàn)astStart Universal SYRB Green Master（ROX）（TAKARA），IL-17A引物：上游：5’-CTGAT CAGGACGCGCAAAC-3’；下游：5’-TCGCTGCTGCCTTCACTGTA -3’，β-actin引物：上游：5’-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3’；下游：5’-TCTGCATCCTGTCAGCAATG-3’ （TAKARA）。

1.2 建立動物模型

1.2.1 四周齡雄性清潔級C57BL/6小鼠50只購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，體質(zhì)量（20±2）g。購回后飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，恒溫、恒濕條件下自由攝取食物和水，飼養(yǎng)1周左右后開始試驗(yàn)。

1.2.2 抗原的準(zhǔn)備

將10只雄性C57BL/6小鼠的肝臟取出，置冰上剪碎，生理鹽水反復(fù)沖洗除去血液，與等量的生理鹽水進(jìn)行勻漿，勻漿后行超聲粉碎，使肝細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)充分釋出。將勻漿液以2000r/min離心10min以去除細(xì)胞核部分，收集上清液后超速離心機(jī)以241000r/min的速度離心1h。該上清液即含肝抗原，即S-100抗原。此抗原需在用前新鮮制備效果較好。

1.2.3 模型構(gòu)建

將實(shí)驗(yàn)動物按照數(shù)字分組法隨機(jī)分為2組，每組20只。第1組（對照組），第1天和第7d以0.5mL的生理鹽水與等體積的佛氏完全佐劑（CFA）充分乳化后予小鼠腹腔注射；第2組（模型組），第1天和第7天以新鮮制備的0.5～2.0g/L的S-100 0.5mL與等體積的CFA充分乳化后予小鼠腹腔注射。各組小鼠于第28天后處死。水合氯醛麻醉后摘取眼球采集外周血，以2000r/min離心10min后分離血清于-20℃短期保存待測，后脫頸處死小鼠，取出肝臟和脾臟組織，肝臟組織經(jīng)10%的福爾馬林固定，石蠟包埋，切片待行肝臟組織HE染色，光鏡觀察。脾臟組織立即提取淋巴細(xì)胞。

1.2.4 C57BL/6小鼠自身免疫性肝炎造模成功的確定

處死小鼠后檢測模型組和正常對照組血清中的白蛋白、球蛋白、AIT、AST、TBIL、抗平滑肌抗體（SMA）和抗核抗體（ANA）的水平，肝臟組織的HE染色觀察炎癥程度。所有的這些結(jié)果可用來估計自身免疫性肝炎C57BL/6小鼠模型構(gòu)建是否成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化

取小鼠肝臟組織標(biāo)本經(jīng)10%的中性甲醛固定后石蠟包埋切片，約4μm厚度，經(jīng)梯度酒精固定、二甲苯脫蠟后，用3%的雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗PBS浸泡后，枸櫞酸鹽緩沖液高溫修復(fù)，滴加山羊血清進(jìn)行封閉，甩去血清后加兔抗小鼠（1∶200）后置于濕盒中4℃過夜孵育，PBS沖洗后滴加羊抗兔抗體，室溫孵育30min，PBS沖洗后加DAB顯色劑顯色，梯度酒精脫水、二甲苯透明后用中性樹膠封片。借助圖像分析系統(tǒng)對組織切片中的陽性細(xì)胞進(jìn)行圖像分析。

1.3.2 脾臟淋巴細(xì)胞的提取和培養(yǎng)：

從小鼠體內(nèi)取出脾臟，用PBS沖洗后，置于200M的尼龍網(wǎng)上研磨，研磨出的細(xì)胞過濾到盛有3mL的1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，將含研磨后細(xì)胞的1640細(xì)胞培養(yǎng)基沿管壁緩慢加入到已盛有6mL淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2000r/min離心15min，收集淋巴細(xì)胞到另一離心管中，加入3mL的1640細(xì)胞培養(yǎng)基，再次離心，1500r/min離心15min后，棄掉上清液，加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的1640細(xì)胞培養(yǎng)基，使細(xì)胞懸浮，計數(shù)后，將懸浮細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)約（0.5～0.8）×106/mL。從一只小鼠提取出的脾淋巴細(xì)胞分三組：第一組空白組，細(xì)胞不予任何處理；第二組IL-23組，在0、24h、48h時加入20ng/mL的IL-23；第三組IL-23+抗CD3單抗組，加入2μg/mL的抗CD3抗體，并在0、24h、48h時加入20ng/mL的IL-23。將24孔板放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.3.3 IL-17在細(xì)胞上清液中的表達(dá)水平

淋巴細(xì)胞在培養(yǎng)72h后，收集細(xì)胞上清液，-80℃凍存，檢測時取出，在室溫下放置20min以平衡室溫，用采用雙抗體夾心法ELISA試劑盒，嚴(yán)格按照操作說明的方法，檢測IL-17A在細(xì)胞上清液的水平，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。

1.3.4 熒光定量PCR

收集培養(yǎng)72h后的淋巴細(xì)胞，嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行操作：①總RNA的提取：棄去上清，按細(xì)胞1×107/mL加入1mL的RNAiso試劑提取總RNA；②將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；③在ABI Prism7300熒光定量PCR儀上兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后設(shè)定基線值和閾值，讀取閾循環(huán)（Ct）值。采用2-△△Ct方法計算相對定量結(jié)果。PCR反應(yīng)條件：95℃變性30s，95℃5s，60℃31s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組均數(shù)間的比較，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠血清中ALT、AST、TBIL、A、G的含量變化以及抗核抗體的檢查，小鼠血清中ALT、AST、A、G含量比較，模型組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），雖然模型組血清中TBIL的含量較對照組的高，但兩者差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。同時，在熒光顯微鏡下我們并未見到SMA特異性線性熒光，但可見到較為明顯的ANA特異性熒光。

表1 小鼠血清生化指標(biāo)的檢測結(jié)果

2.2 小鼠肝臟組織病理變化

對照組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細(xì)胞浸潤。模型組小鼠均觀察到肝臟的不同病變，在肝小葉和匯管區(qū)可見到淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤為主的炎性反應(yīng)，中間夾雜少量的中性粒細(xì)胞。部分細(xì)胞嚴(yán)重浸潤破壞了肝小葉的正常結(jié)構(gòu)，可出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死、片狀壞死（圖1）。

圖1-1 正常對照組小鼠血清中抗核抗體的表達(dá)(免疫熒光×200倍)

圖1-2 模型組小鼠血清中抗核抗體的表達(dá)(免疫熒光×400倍)

2.3 IL-17在自身免疫性肝炎小鼠肝細(xì)胞的表達(dá)

為研究IL-17在自身免疫性肝炎病理機(jī)制中的重要作用，我們通過免疫組化的方法分析IL-17A在肝細(xì)胞中的分布及表達(dá)水平。結(jié)果如圖2所示：正常對照組小鼠的肝細(xì)胞中幾乎沒有IL-17A的表達(dá)，而模型組小鼠的肝細(xì)胞中有明顯的IL-17A+細(xì)胞浸潤，并且IL-17A+細(xì)胞主要分布于匯管區(qū)和肝小葉區(qū)，并有大量的淋巴細(xì)胞浸潤。同時結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-17A+細(xì)胞的頻數(shù)與肝臟的炎性程度成正相關(guān)（r=0.70，P＜0.01）。

2.4 IL-17A在淋巴細(xì)胞上清液中的表達(dá)

模型組和對照組的淋巴細(xì)胞在相同條件下分組進(jìn)行培養(yǎng)后，收集細(xì)胞上清液后經(jīng)ELISA檢測發(fā)現(xiàn)：空白組中，模型組培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞上清液中IL-17A的含量較對照組中的高，兩者有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；在IL-23組和IL-23+抗CD3單抗組中，與對照組相比較，模型組細(xì)胞上清液中IL-17A的含量顯著升高（P＜0.05）；而且，在模型組中，經(jīng)IL-23刺激活化后淋巴細(xì)胞的上清液中IL-17A的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖2，表2）。

圖2-1 正常對照組小鼠肝組織(HE×100倍)

圖2-2 模型組小鼠肝組織(HE× 400倍)

表2 上清液中IL-23對IL-17A表達(dá)的影響（濃度pg/mL）（n=18）

2.5 IL-17A mRNA在淋巴細(xì)胞中的表達(dá)水平

熒光定量PCR檢測結(jié)果：空白組中，模型組培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞中IL-17A mRNA水平比對照組的高，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；在IL-23組和IL-23+抗CD3單抗組中，與對照組相比較，模型組淋巴細(xì)胞中IL-17A mRNA的表達(dá)水平升高（P＜0.01）；且在模型組中，IL-23刺激活化后比刺激未活化更高，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表3）。

表3 淋巴細(xì)胞中IL-23對IL-17A mRNA表達(dá)的影響（Ct）（n=17）

圖3-1 正常對照組小鼠肝組織(免疫組化×400倍)

圖3-2 模型組小鼠肝組織(免疫組化×400倍)

3 討 論

近年來，AIH的發(fā)生率逐漸上升，引起人們的廣泛關(guān)注，但其病因及發(fā)病機(jī)制仍不清楚，而缺乏典型的AIH動物模型可能是其主要原因之一。AIH動物模型的構(gòu)建方法有多種，目前比較經(jīng)典的主要有以下四種：肝抗原、刀豆蛋白A（ConA）、α-半乳糖基神經(jīng)酰胺（α-GalCer）誘導(dǎo)的肝炎動物模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型。其中，ConA和α-GalCer更傾向于誘導(dǎo)肝臟的急性炎性反應(yīng)，且所產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子維持時間較短，與人AIH的特點(diǎn)不相符合，而轉(zhuǎn)基因小鼠雖然是近年來的研究熱點(diǎn)，但是由于肝臟作為AIH的靶器官，存在強(qiáng)大的免疫耐受，難以建立成功的AIH模型，且造模的方法比較復(fù)雜，所以，基于以上原因，我們采用易感動物C57BL/6小鼠，以S-100肝抗原與佛氏完全佐劑充分乳化后，2次腹腔注射即誘導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎。操作方法簡單，且免疫持續(xù)時間較久，肝臟組織學(xué)改變與人自身免疫性肝炎的組織學(xué)特征相似，均有大量炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主，伴肝細(xì)胞點(diǎn)狀、片狀壞死，同時模型組小鼠血清中A/G比值倒置、轉(zhuǎn)氨酶升高、血清中抗核抗體（ANA）陽性均符合臨床病例特點(diǎn)。綜合上述證明該模型是成功的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎小鼠模型。

Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的一種區(qū)別于Th1和Th2的輔助性T細(xì)胞，其在表現(xiàn)、功能和形成途徑都與其他兩種不同[13]。而IL-17作為Th17細(xì)胞分泌的關(guān)鍵性促炎因子，通過誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌多種炎癥介質(zhì)和趨化因子，募集中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，引起組織損害[14]。近來，越來越多的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-17在肝臟的炎癥作用中發(fā)揮一定的重要性。原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）病人外周血中IL-17和肝臟中IL-17+細(xì)胞都明顯增多[15]。國外已有研究報道IL-17在一些自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著十分重要的作用，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）[16]、EAE[17]、IBD[18]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）[19]。事實(shí)上，已有研究發(fā)現(xiàn)IL-17在一些肝臟疾病的病理機(jī)制中發(fā)揮一定的作用[20]，但它在AIH中的作用仍不清楚。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，在EAH小鼠中IL-17A的蛋白和分子水平明顯升高。而且，在EAH小鼠的肝臟中存在明顯的IL-17A+細(xì)胞浸潤，IL-17A+細(xì)胞的表達(dá)與炎癥程度成正相關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)說明IL-17A可能與EAH的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

IL-23是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，與IL-12共同分享IL-12p40和IL-12Rβ1亞單位[21]，但其功能和作用與IL-12不同。研究發(fā)現(xiàn)IL-23受體只在活化的輔助T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞中表達(dá)，對于Th17細(xì)胞的存活、增殖以及IL-17的分泌至關(guān)重要。近年來，越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL-23參與的Th17細(xì)胞引起的炎性反應(yīng)即IL-23/IL-17炎癥軸被認(rèn)為在自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[22]，但I(xiàn)L-23與IL-17在AIH疾病中的相互關(guān)系仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)中，與對照組相比，模型組中IL-23可促進(jìn)活化的淋巴細(xì)胞分泌IL-17A，使其表達(dá)量明顯升高。而對未活化的淋巴細(xì)胞中IL-17的作用則不十分明顯。這些結(jié)果說明了IL-23可能通過上調(diào)活化的淋巴細(xì)胞中IL-17A的表達(dá)而在EAH疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮獨(dú)特的作用。研究發(fā)現(xiàn)在IBD、多發(fā)性硬化和自身免疫性葡萄膜炎各自的臨床表現(xiàn)、病理特征以及自身抗體都不相同，但有研究指出在這些自身免疫性疾病中IL-23和IL-17的表達(dá)都上調(diào)[23,24]，可以說IL-23/IL-17可能是這些自身免疫性疾病的一個獨(dú)特的炎癥通路，而這個炎癥通路可能為這些自身免疫性疾病提供新的治療策略。本實(shí)驗(yàn)僅說明IL-17在EAH小鼠中的表達(dá)升高，IL-23可能通過上調(diào)活化的淋巴細(xì)胞中IL-17A而發(fā)揮作用，但并未對IL-23在EAH中的表達(dá)以及IL-23和IL-17之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，同時對于研究IL-23可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分泌IL-17炎性因子的轉(zhuǎn)錄機(jī)制也很關(guān)鍵，這些都有待于進(jìn)一步研究。

總之，IL-23/IL-17炎癥通路在EAH小鼠的發(fā)病機(jī)制中有著十分重要的作用，更深層次的理解IL-23/IL-17炎癥通路可能對于AIH疾病的治療和預(yù)防提供新的靶點(diǎn)。

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The Role of IL-23/IL-17 in Experimental Autoimmune Hepatitis

LI Xiao-ni, DENG Zhi-hua*, HE Jing, WANG Qi
(Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001,China)

Objective To investigate the variation of IL-17 in the model mice of experimental autoimmune hepatitis with exogenous IL-23 for its possible pathogenesis. Methods The C57BL/6 mice were immunized with S-100 to establish the model of experimental autoimmune hepatitis (EAH), the distribution and the expression levels of cytokines (IL)-17 in the murine liver using immunohistochemical method and lymphocyte from murine spleen were activated with anti-CD3antibody and treated with IL-23 in vitro, the cytokines, IL-17 were detected using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and ELISA. Result The results were compared with those of normal controls, the expression of IL-17 were increased；We demonstrated that there were significantly increased IL-17A+ cells in livers of AIH mice, compared to normal mice using immunohistochemical method, and the expression of IL-17A was significant increase after treatment with IL-23 vs the non-IL-23-treatment control group and the cultured cells both were activated with anti-CD3antibody in AIH mice. Conclusion Our findings indicate that the IL-23/IL-17 inflammation axis play an important role in the pathogenesis of AIH, IL-23 on EAH may up-regulate the expression of IL-17 to accelerate the progress EAH, and which might be a target for treatment.

Experimental autoimmune hepatitis; IL-17; IL-23

R512.6

B

1671-8194（2013）24-0012-04

*通訊作者：E-mail:ykdzh@yahoo.com.cn