阿拉伯糖異構(gòu)酶的重組表達(dá)及性質(zhì)研究

王玥，劉秀梅，魏曉琨，朱玲

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.上海斯貝生物科技有限公司，上海 200235）

D-塔格糖（D-tagatose）是一種低熱量與蔗糖甜度相近的食品甜味劑[1-2]。對(duì)其他甜味劑也有較好的協(xié)同增效作用[3]。D-塔格糖的生理功效體現(xiàn)在控制高血糖和糖尿病并發(fā)癥[4-5]、平衡腸道菌群[6]、預(yù)防齲齒[7]等方面。大量毒理試驗(yàn)證明塔格糖安全無毒，國際上很多國家包括美國，新西蘭和澳大利亞以及中國，已批準(zhǔn)其在食品中廣泛應(yīng)用[8-9]。

截止到21 世紀(jì)初，D-塔格糖的制備主要有化學(xué)和生物兩種轉(zhuǎn)化方法。化學(xué)轉(zhuǎn)化的問題是產(chǎn)物復(fù)雜難于與目標(biāo)產(chǎn)物分離[10]；生物轉(zhuǎn)化法包括發(fā)酵法和酶法[11]。發(fā)酵法周期長產(chǎn)量低，不適合工業(yè)擴(kuò)大生產(chǎn)。酶法制備則是以D-半乳糖為原料，在L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化下進(jìn)行轉(zhuǎn)化[12]。L-阿拉伯糖異構(gòu)酶由araA 基因編碼，參與L-阿拉伯糖的代謝。由于D-半乳糖和L-阿拉伯糖在三維結(jié)構(gòu)上相似，見圖1，因此L-阿拉伯糖異構(gòu)酶還能催化D-半乳糖生成D-塔格糖[13]。該酶在用于生產(chǎn)D-塔格糖中具有很大商業(yè)價(jià)值[14]。

圖1 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)Fig.1 In vivo and in vitro reactions catalyzed by AI

本文采用DNA 重組技術(shù)構(gòu)建了一株高表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因工程菌，將E.coli K12 基因組中的araA 基因插入載體pET-32a，并轉(zhuǎn)入宿主菌BL21（DE3）中高效表達(dá)，隨后對(duì)粗酶的酶活和最適酶活條件進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌K12（Escherichia coli）、大腸桿菌BL21（DE3）、載體pET-38a 為上海斯貝生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)室保存；pMD-18T 載體購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司；DNA 回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司并由該公司完成PCR 引物合成；2xTaq PCR MasterMix 購自天根生化科技有限公司；測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。其它試劑均為市售分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2；固體培養(yǎng)基中添加1.5%的瓊脂；固體、液體LB 培養(yǎng)基使用時(shí)按需要添加氨芐青霉素（Amp，終濃度100 μg/mL）。

1.2 方法

1.2.1 araA 基因的PCR 擴(kuò)增

根據(jù)GenBank 中大腸桿菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶（ECAI）基因序列設(shè)計(jì)PCR 引物，分別為araA（+）：GCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTT TAAGAAGGAGA TATACCATGACGATTTTTG，Xba I，rbs（點(diǎn)劃線）；araA（-）：GGAAGCTTTTAGCGACGAA ACCCGTAATA CAC TTCGTTC，Hind Ⅲ。

由于選用的酶切位點(diǎn)為Xba I 和Hind III，質(zhì)粒上的RNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)被切除，故須在引物araA（+）處補(bǔ)入，，確?；虻恼＾D(zhuǎn)錄。PCR 擴(kuò)增的模板為大腸桿菌K12 基因組DNA，于94 ℃預(yù)變性5 min，變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30 次，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建以及目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將回收的PCR 產(chǎn)物連接到pMD-18T 載體上并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α，篩選氨芐抗性的陽性克隆，經(jīng)測(cè)序正確，將目標(biāo)片段克隆到pET-32a 上，并轉(zhuǎn)化入E.coli BL21（DE3）中，篩選氨芐抗性的陽性克隆。將該陽性克隆菌株于37 ℃條件下置于50 μg/mL 氨芐霉素LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)得OD600達(dá)到0.4～0.6 時(shí)加入IPTG 至0.5 mmol/L，15 ℃誘導(dǎo)10 h，4 000 r/min 離心20 min，收集菌體，用50 mmol/L Tris-HC（lpH7.6）重懸菌體。誘導(dǎo)產(chǎn)物用12%的SDS-PAGE 分析。

1.2.3 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的酶活測(cè)定

以重懸菌體為粗酶源、D-半乳糖作為酶活測(cè)定的底物，3 mL 酶活測(cè)定體系包括0.6 mL 菌懸液，0.4 g/L D -半乳糖，1 mmol/L MnCl2，50 mmol/L Tris -HCl（pH7.6）。60 ℃反應(yīng)1 h，每隔15 min 取樣0.5 mL 到0.5 mL 0.1 mol/L HCl 中，測(cè)定D-塔格糖含量。D-塔格糖含量的測(cè)定采用半胱氨酸－咔唑法[15]。在上述測(cè)定條件下，將每小時(shí)產(chǎn)生1 μg D-塔格糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。

1.2.4 酶活最適條件的測(cè)定

根據(jù)上述酶活測(cè)定方法，分別從溫度、pH、二價(jià)金屬離子以及Mn2+濃度四個(gè)方面來研究酶活測(cè)定的最適條件。

溫度：分別在30、37、40、50、60、70 ℃下測(cè)定酶活，其中反應(yīng)體系pH 為7.6，離子為Mn2+。

pH：采用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液（pH 4.92～8.18）和Tris-HCl 緩沖液（pH 7.10～9.00），在pH 6、pH 6.6、pH 7、pH 7.6、pH 8、pH 8.6、pH 9 條件下進(jìn)行酶活測(cè)定。反應(yīng)溫度為60 ℃，離子為Mn2+。

二價(jià)金屬離子：在Mn2+、Co2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+存在下測(cè)定酶活，各離子濃度均為1 mmol/L，以不加入任何二價(jià)金屬離子所測(cè)定的酶活為對(duì)照。

Mn2+濃度：向重懸菌體中加入10 mmol/L EDTA 以去除金屬離子，37℃處理2h。離心去上清，再用50mmol/L Tris-HCl（pH7.6）重懸。酶活測(cè)定中分別加入0、1、3、5、7、9 mmol/L Mn2+來檢測(cè)Mn2+濃度對(duì)酶活的影響。以未經(jīng)EDTA 處理的酶的酶活為參照。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒pET-38a-araA 的構(gòu)建與鑒定

以大腸桿菌K12 基因組模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增araA得到1 500 bp 左右的特異性條帶，其大小與理論預(yù)期一致。回收目標(biāo)條帶，直接連接到pMD-T 載體上，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α，篩選氨芐抗性的陽性克隆，并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank 上公布的大腸桿菌K12 的araA 基因（EG10052）相比，第213 位的由T 變?yōu)镃，第1395 位由C 變化T。但是對(duì)照密碼子表，兩者都是第三位發(fā)生突變，前者由GAT 變成GAC，但其對(duì)應(yīng)的氨基酸未變，仍然為天冬氨酸；后者由TTC 變成TTT，對(duì)應(yīng)的氨基酸仍然為苯丙氨酸。因此，基因序列的突變并不影響目的蛋白的序列。

將T 載體雙酶切得到1 500 bp 左右的條帶克隆到質(zhì)粒pET-32a 上，獲得重組質(zhì)粒pET-32a-araA，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21（DE3）中，篩選氨芐抗性的陽性克隆菌落，獲得重組araA 的工程菌AraA。

2.2 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的誘導(dǎo)表達(dá)

將上述構(gòu)建的工程菌AraA，按材料與方法中所述進(jìn)行培養(yǎng)及誘導(dǎo)，所得菌體經(jīng)超聲波破碎，并經(jīng)SDSPAGE 電泳，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 重組菌AraA SDS-PAGE 蛋白電泳圖Fig.2 SDS-PAGE result of expression product of araA

經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，L-阿拉伯糖異構(gòu)酶在宿主菌E.coli BL21（DE3）中有顯著的表達(dá)，見圖2 的Line2、3，其大小約為56 kDa，與文獻(xiàn)報(bào)道的L-AI 的單體分子量（Mr=56 074 Da）大小一致。目的蛋白大部分為胞內(nèi)表達(dá)，離心沉淀中仍有少量包涵體存在，見圖2 的Line7。

對(duì)相同濃度的重懸菌體、重懸菌體破碎液、破碎上清和破碎沉淀進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果見圖3。

圖3 不同類型酶源的活力比較Fig.3 The activity construction of suspension of AI

通過比較，重懸菌體的酶活最高，因此酶活測(cè)定時(shí)均采用重懸菌體作酶源。與重懸菌體相比，由于超聲破碎對(duì)酶活產(chǎn)生影響，導(dǎo)致菌體破碎液的酶活有一定下降。破碎液中的酶活完全來自于上清液中的可溶蛋白，這說明包涵體中的蛋白沒有活性。

2.3 最適酶活條件

2.3.1 溫度

按照酶活測(cè)定方法，在不同的溫度下考察重組菌的酶的活力，確定最適酶活溫度，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對(duì)酶活測(cè)定的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of AI

從圖4 中可以看出，隨著溫度的增加，酶活不斷增大，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大活力，最高酶活為746.8 U/mL，并設(shè)為100%作為對(duì)照。雖然大腸桿菌的最適生長溫度為37 ℃，可此時(shí)的酶活卻僅為最高酶活的43%。明顯不同于文獻(xiàn)[12-15]中所述的37 ℃為最適酶活溫度，即常溫菌中AI 的最適酶活溫度能夠達(dá)到嗜熱菌中AI 的最適酶活溫度。這是前所未有的。

2.3.2 pH

采用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液（pH 6、pH 6.6、pH 7）和Tris-HCl 緩沖液（pH 7.6、pH 8、pH 8.6、pH 9），在不同pH 條件下對(duì)L-AI 進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果見圖5。

圖5 pH 對(duì)酶活測(cè)定的影響Fig.5 Effect of pH on the activity of AI

從圖5 中可以看出，在酸性條件下，L-AI 具有極低的活力，因此L-AI 不適合在酸性條件下進(jìn)行反應(yīng)。在堿性條件下，隨著pH 的逐漸增加，L-AI 活力逐漸下降。在pH7.6 時(shí)達(dá)到最高活力，最高活力為619.6 U/mL。

2.3.3 二價(jià)金屬離子

在Mn2+、Co2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+存在下測(cè)定酶活，各種離子濃度均為1 mmol/L，以不加入任何金屬離子所測(cè)定的酶活為對(duì)照，結(jié)果見圖6。

從圖6 中可以看出，測(cè)定中添加Mn2+、Co2+和Fe2+能明顯地提高酶活，且Mn2+最高，相對(duì)活力高達(dá)190%。Mg2+、Ca2+和Ni2+對(duì)提高酶活的影響不太明顯，而Zn2+和Cu2+卻抑制了酶活測(cè)定。其中不加入任何金屬離子時(shí)的酶活為304 U/mL，并設(shè)為100%作為對(duì)照。

圖6 金屬離子對(duì)酶活測(cè)定的影響Fig.6 Effect of divalent metallic ion on the activity of AI

2.3.4 Mn2+濃度

以EDTA 處理后的重懸菌體為酶源，分別加入0、1、3、5、7、9 mmol/L Mn2+來檢測(cè)Mn2+濃度對(duì)酶活的影響，結(jié)果見圖7。以未經(jīng)EDTA 處理的酶的酶活為參照（100%）。

圖7 Mn2+濃度對(duì)酶活測(cè)定的影響Fig.7 Effect of concentration of Mn2+on the activity of AI

從圖7 可以看出，經(jīng)過EDTA 處理后，酶完全沒有活性。加入Mn2+后，可以使EDTA 處理過的酶重新恢復(fù)活力。但活力恢復(fù)后，酶活并不隨著Mn2+濃度的增加而增加。這表明L-阿拉伯糖異構(gòu)酶需要Mn2+催化，而且加入Mn2+有助于提高酶活，但提高酶活的量是有限度的。其中未經(jīng)EDTA 處理的酶液的酶活為660 U/mL，并設(shè)為100%作為對(duì)照，活力恢復(fù)后的酶活均能達(dá)到590 U/mL 以上。

3 討論

本研究中選擇E.coli K12 基因組作為模板，用PCR 方法克隆得到L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因araA，并將其轉(zhuǎn)入表達(dá)載體pET-32a 中?；诒磉_(dá)載體上T7 lac 的強(qiáng)啟動(dòng)表達(dá)功能，使得目的蛋白在宿主菌BL21（DE3）中得到很高的表達(dá)量。經(jīng)SDS-PAGE 分析，15 ℃誘導(dǎo)10 h 后，目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在于菌體中，而無活性的包涵體表達(dá)量極低。以重懸菌液為酶源、D-半乳糖為底物，測(cè)定了L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的最適酶活條件。其結(jié)果表明：酶的最適溫度為60 ℃，最適pH 為7.6，酶活測(cè)定中加入Mn2+能顯著提高酶活，1 mmol/L Mn2+能使酶活相對(duì)提高50%。

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