超聲波輔助提取水溶性山苦茶多糖

蘇冰霞，吳學(xué)進，葉海輝，張艷玲

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，海南?？?571101）

茶多糖（Tea po1ysaccharides，簡稱TPS）是茶葉中一類與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的酸性多糖或酸性糖蛋白，具有特殊生物活性。藥理研究表明，茶多糖具有顯著的降血糖效果和免疫活性，使茶多糖可望成為預(yù)防與治療糖尿病及心血管疾病，提高免疫功能的天然藥物[1]。若從茶葉中提取茶多糖作為保健食品的功能因子，則可為中低檔茶葉的綜合利用和提高社會經(jīng)濟效益開辟新途徑。

關(guān)于茶多糖的提取方法在紅茶和綠茶方面的研究報道較多，主要是酸提法、堿提法、水提法、酶提法和超聲波提取法等[2]。而對山苦茶多糖提取尚無報道，山苦茶是海南植物資源中一種具有經(jīng)濟價值的天然產(chǎn)物，遍布于海南各地。其為野生的喬木樹葉清蒸晾制而成，未經(jīng)傳統(tǒng)炒茶工藝，因而泡出來的茶水清香中夾著一種植物特有的味道，是一種奇特的野生茶葉，不僅香味濃烈，又能解毒清熱、消食利膽，是理想的解油膩、助消化的保健飲品[3]。由于浸提條件對茶多糖的提取得率和生物活性有著直接的影響，本研究采用超聲波輔助提取山苦茶多糖，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計的方法分析影響山苦茶水溶性多糖得率的影響因子如超聲波功率、超聲波時間、水茶比、浸提時間、浸提溫度。對浸提條件進行優(yōu)化篩選，為工業(yè)化提取茶多糖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山苦茶（購自?？谵r(nóng)貿(mào)市場）。

石油醚（沸程60 ℃～90 ℃）、95%乙醇、復(fù)合蛋白酶（諾維信公司）、氯仿、正丁醇等。

所用試劑均為分析純。實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 試驗儀器

AE200 型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-3900 紫外可見分光光度計：日本島津公司；KQ3200DE 數(shù)控超聲清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；植物粉碎機，回流裝置一套；數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市富華儀器有限公司；電熱真空干燥箱：上海市實驗儀器總廠；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；低速臺式大容量離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲波輔助提取工藝流程

山苦茶→烘干粉碎至20 目茶葉末→石油醚脫脂→濾渣干燥→90%乙醇，浸提2 次→過濾→濾渣干燥→濾渣加入蒸餾水超聲波輔助浸提→熱水浸提（70 ℃）→濾液濃縮→Sevag 試劑和蛋白酶結(jié)合脫蛋白→80%乙醇沉淀→離心（4 000 r/min，10 min）→50 ℃烘箱干燥至恒重→得黃褐色、粉末狀粗多糖→稱重，計算粗多糖得率。

1.3.2 粗茶多糖得率

茶多糖得率（%）=[得到的茶多糖的質(zhì)量（g）/山苦茶總質(zhì)量（g）]×100。

1.3.3 多糖提取單因素試驗設(shè)計

利用單因素試驗分別考察液料比、超聲功率、超聲時間、超聲溫度、熱水浸提時間5 個因素對山苦茶多糖得率的影響，選擇最佳的提取工藝條件。

1.3.4 正交試驗設(shè)計

為優(yōu)化提取工藝條件，參照單因素試驗結(jié)果設(shè)計正交試驗L16（45），其因素及水平見表1。

表1 超聲波輔助提取因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for ultrasonic assistant extraction

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對山苦茶多糖的影響

稱取10g 山苦茶各五份，按液料比10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1 分別加入70 ℃蒸餾水，在超聲波功率200 W，超聲溫度50 ℃條件下超聲處理30 min 結(jié)果見圖1。

由圖1 可知，液料比在10 ∶1～20 ∶1 之間時，山苦茶多糖得率上升最為迅速。液料比高于20 ∶1 時，多糖的得率趨于穩(wěn)定，隨之有所下降。這是由于山苦茶多糖從細胞到溶劑是一個由濃度差推動的擴散過程，溶劑用量越多細胞內(nèi)外的濃度差就越大。當溶劑增加到一定程度之后再增加溶劑用量并不會明顯提高多糖的得率。

圖1 液料比對山苦茶多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid/material ratio on extraction rate of Mallotus furetianus tea polysaccharides

2.1.2 超聲波功率對山苦茶多糖的影響

選用不同的超聲波功率進行提取。稱取10 g 山苦茶葉各6 份，按液料比20 ∶1 加入70 ℃蒸餾水，在60 ℃，50、100、150、200、250、300 W 條件下超聲處理，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲波功率對大豆多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction rate of Mallotus furetianus tea polysaccharides

由圖2 可知，當功率較小時，山苦茶多糖的得率隨著超聲波功率的提高而提高，因為加大超聲波功率，超聲空化作用加強，機械剪切作用也加強，有助于細胞多糖的溶出。但當功率達到一定程度（200 W）時，功率再進一步提高，得率反而呈下降趨勢。這是因為功率過大可能會使多糖分子降解程度加大，故超聲波功率以150 W～200 W 為宜。

2.1.3 超聲時間對山苦茶多糖的影響

稱取10 g 山苦茶各6 份，按液料比25 ∶1（mL/g）加入70 ℃的蒸餾水，在60 ℃、200 W 的功率條件下超聲處理10、20、30、40、50、60 min，結(jié)果見圖3。

從圖3 可知，超聲波輻射時間少于40 min 時，超聲波輻射時間越長，多糖得率越高。處理40 min 時多糖得率達到最大。超聲波輻射時間再延長，多糖得率開始緩慢下降，可能是由于超聲波較強的機械剪切作用，長時間處理不僅會使大分子多糖降解，同時也使蛋白質(zhì)等其他雜質(zhì)開始溶出，得到的多糖含量下降。故用超聲波處理多糖浸提液的時間以40 min 為宜。

圖3 超聲波輻射時間對山苦茶多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on extraction rate of Mallotus furetianus tea polysaccharides

2.1.4 提取溫度對山苦茶多糖得率的影響

稱取10 g 山苦茶各五份，按液料比20 ∶1（mL/g）加入蒸餾水，蒸餾水溫度分別為50、60、70、80、90 ℃，超聲波條件調(diào)至60 ℃、200 W 功率條件下處理40 min，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對山苦茶多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of Mallotus furetianus tea polysaccharides

由圖4 可知多糖得率隨提取溫度的升高不斷提高，因為提取溫度升高會加快溶液的擴散速率，促進細胞內(nèi)的多糖物質(zhì)向外擴散。提取溫度為70 ℃時得率達到最大，提取溫度過高還會破壞山苦茶多糖的結(jié)構(gòu)，故提取溫度選擇70 ℃為宜。

2.2 超聲波輔助提取正交試驗

設(shè)定熱水浸提溫度70 ℃，以山苦茶多糖得率作為評價指標，確定最佳提取工藝條件，各因素試驗安排及結(jié)果見表2。

由表2 中極差大小可以看出，超聲波功率（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）、液料比（D）、浸提時間（E）對山苦茶多糖得率影響的大小順序是A＞C＞B＞E＞D；根據(jù)正交試驗結(jié)果最佳工藝條件為A3B2C4D3E1，即超聲波功率200 W、超聲時間40 min、超聲溫度70 ℃、液料比20 ∶1，此時多糖得率為9.976%。由表3 可知，超聲波功率和超聲溫度對山苦茶水溶性多糖溶出影響顯著，其他三個因素影響不顯著。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

表3 茶多糖正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment of tea polysaccharides extraction

3 討論

1）熱水提法提取物的雜質(zhì)較多，但較簡便易行。而采用超聲波輔助提取法提取，利用超聲波產(chǎn)生的強烈振動、超高的速度、強烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等，可加速有效成分進入溶劑，超聲波技術(shù)因具有成本低、安全、操作簡單、污染小或無污染等一系列優(yōu)點近年來越來越多地被用于有效成分的提取[4]。

2）將山苦茶脫脂及小分子糖類等雜質(zhì)后，采用單因素試驗和正交試驗的結(jié)果得出，超聲波輔助提取山苦茶多糖的最佳工藝為超聲波功率200 W、超聲時間20 min、超聲溫度70 ℃，熱水浸提溫度70 ℃、液料比20 ∶1 時，浸提時間30 min 時，水溶性山苦茶多糖的得率為9.976%。在影響茶多糖提取得率的5 個因素中，超聲波功率和超聲溫度的影響達到顯著水平，而超聲時間、熱水浸提時間、液料比的影響不顯著。因此確定了山苦茶多糖超聲波輔助提取工藝的可行性，為山苦茶的開發(fā)研究提供實驗數(shù)據(jù)和前期基礎(chǔ)工作。

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