魔芋葡甘寡聚糖硫酸酯的純化與結(jié)構(gòu)表征

黃皓，楊忠華，王光輝，陳俊，秦曉蓉

（武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430081）

魔芋是食藥兩用的多年生草本植物，屬天南星科魔芋屬。魔芋葡甘聚糖（KGM）在魔芋塊莖中含量高達(dá)55%～80%，KGM 單體的分子中C2、C3、C6均具有較強(qiáng)的反應(yīng)活性，表現(xiàn)出優(yōu)良的生物親和性，易制成各種化學(xué)衍生物[1]。

由于多糖硫酸酯具有顯著的抗病毒活性，且其活性與相對(duì)分子質(zhì)量大小、硫酸基含量和取代位置及構(gòu)象密切相關(guān)[2]。為更好地拓展魔芋作為功能食品的應(yīng)用范圍，研究其體外抗病毒活性的可能性，為糖類生化藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)，本文報(bào)道了經(jīng)改良的氯磺酸-甲酰胺法制備的聚陰離子產(chǎn)物魔芋葡甘寡聚糖硫酸酯[3]（Hydroxylpropyl Oligo-konjac Glucomannannuroate Sulfate，HOGS）的分離純化及結(jié)構(gòu)表征研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寡聚KGM 醛酸丙酯（HOG）、寡聚KGM 醛酸丙酯硫酸酯（HOGS）：武漢科技大學(xué)化工學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室自制；D-甘露糖、D-葡萄糖（分析純）、葡聚糖凝膠Sephadex G.25、醋酸纖維素薄膜：美國(guó)Sigma 公司；甲苯胺藍(lán)（分析純）：武漢順天生物技術(shù)有限公司；葡聚糖：瑞典Pharmacia 公司。

1.2 儀器設(shè)備

傅里葉變換紅外光譜儀（Nexus 型）：美國(guó)Thermo Nicolet 公司；超導(dǎo)核磁共振波譜儀（AS 600 型）：美國(guó)Varian 公司；凝膠滲透色譜儀（Waters 510 型）：美國(guó)Waters 公司。

1.3 方法

1.3.1 離子交換層析分離HOGS

由于HOGS 帶負(fù)電荷，采用離子交換法將其與HOG 分離。取適量干燥的717 陰離子樹脂經(jīng)NaCl 溶液預(yù)處理后使用。200 mg 合成的HOGS 粗品溶于10 mL蒸餾水，沿管壁加入。流出液接自動(dòng)收集器，流出液中加2 滴α-萘酚試劑，沿試管壁加1 mL 濃硫酸，有糖則在液面間形成紫色復(fù)合物。去離子水展開直至流出液中無糖為止。

1.3.2 葡聚糖凝膠層析純化HOGS

利用分子篩效應(yīng)[4]，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的差異對(duì)HOGS 進(jìn)一步純化。Sephadex G.25 凝膠柱用0.2 mol/L NaCl 溶液平衡、流速為5 mL/h～6 mL/h，上樣（10 mg 樣品溶于1 mL 蒸餾水），保持流速，用0.04 mol/L 吡啶：0.02 mol/L 醋酸（1 ∶1）緩沖液洗脫，BSZ.160 自動(dòng)部分收集器收集洗脫分離樣品，轉(zhuǎn)速4.0 r/min，按3 mL 體積分步收集，作洗脫曲線。

1.3.3 醋酸纖維素薄膜電泳鑒定HOGS 純度

取醋酸纖維素薄膜（2×8 cm）放在pH 12.5 的0.025 mol/L 硼酸鹽緩沖液中浸泡15 min～20 min，取膜條，夾在兩層濾紙內(nèi)吸去多余的緩沖液。另切1 mm～5 mm 薄膜浸漬樣品溶液約1 μL（10 μg），緊貼離膜條一端2 cm 處，使膜條點(diǎn)上細(xì)條狀的多糖樣品。按常規(guī)電泳方法，經(jīng)過電泳、染色、漂洗至無糖區(qū)染色劑的底色完全脫去為止。

1.3.4 凝膠滲透色譜（GPC）測(cè)定HOGS 相對(duì)分子質(zhì)量

凝膠滲透色譜法測(cè)定HOGS 的重均相對(duì)分子質(zhì)量（Mw）、數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量（Mn）和多分散系數(shù)（Mw/Mn）。采用TSKG-3000SW 凝膠過濾柱（300 mm×7.5 mm），在Waters 510 型HPLC 儀上進(jìn)行分離，檢測(cè)器為410 型示差檢測(cè)器，并以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定[5]。色譜條件為：柱溫，210 ℃（自動(dòng)柱溫控制系統(tǒng)）；柱壓，5MPa（600 型恒壓泵）；進(jìn)樣器50μL；進(jìn)樣量20μL；流動(dòng)相：HAc-NaAc 緩沖液（pH5）；流速，1.0 mL/min；洗脫時(shí)間，60 min。數(shù)據(jù)處理采用Astra 軟件。

1.3.5 傅里葉紅外光譜（FT-IR）分析

取凍干后的HOG 和HOGS 輾細(xì)，采用Nexus 傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行紅外光譜測(cè)定，選用歐米采樣器直接測(cè)定。波數(shù)范圍：4 000 cm-1至400 cm-1；分辨率：0.09 cm-1；掃描次數(shù)：32/64[6]。

1.3.6 氫核磁共振波譜（1H-NMR）分析

取凍干后的HOG 和HOGS 各0.5 mg 分別溶于1 mL D2O，以D2O 為內(nèi)標(biāo)，定為4.8 ppm，在599.78 MHz 的磁場(chǎng)中，譜線寬度為6 631.8 Hz，操作溫度為298 K，HOD信號(hào)在前3S 預(yù)飽和進(jìn)行抑制，記錄質(zhì)子去偶的1HNMR[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 HOGS 與HOG 的分離

離子交換層析的樣品洗脫液用硫酸-蒽酮法檢測(cè)糖含量，離子交換洗脫曲線見圖1。

圖1 HOGS 離子交換層析洗脫曲線Fig.1 Ion exchange chromatography analysis of HOGS

由圖1 可以看出，在較低濃度0.4 mol/L NaCl 溶液的洗脫下，0～15 管收集液的糖含量為零，未有糖峰出現(xiàn)，表明HOGS 完全被陰離子樹脂吸附，可見本試驗(yàn)中HOG 樣品經(jīng)硫酸化后引入了負(fù)電荷的硫酸基團(tuán)。在0.4、0.8 mol/L 和1.6 mol/L NaCl 的梯度洗脫下，隨著NaCl 濃度的增加，HOGS 與陰離子樹脂的吸附被Cl-競(jìng)爭(zhēng)取代，與樹脂分離，被洗脫下來，在24 管時(shí)糖含量達(dá)到最大，洗脫曲線出現(xiàn)的糖峰為單一峰，表明HOGS 組分均一。

2.2 HOGS 葡聚糖凝膠層析純化結(jié)果

經(jīng)乙醇沉淀、離子交換、透析、冷凍干燥后的HOGS 溶于水，用Sephadex G-25 凝膠層析柱進(jìn)一步純化，以收集管號(hào)為橫坐標(biāo)，糖濃度為縱坐標(biāo)，作凝膠層析洗脫曲線如圖2。

圖2 HOGS 凝膠過濾Sephadex G-25 柱層析圖Fig.2 Sephadex G-25 gel filtration analysis of HOGS

由圖2 可知，在洗脫的初始階段，1～10 管收集液基本上沒有HOGS 成分，糖含量極少。隨著洗脫的繼續(xù)進(jìn)行，從11 管開始，吸光度逐漸增加，表明糖含量逐漸增加，在12～13 管時(shí)達(dá)到最大，此后又逐漸下降。

多糖分子的大小和形狀不同，在層析柱中的移動(dòng)速度也不同，從分部收集中出現(xiàn)的峰的多少和形狀，判斷該多糖的純度，因此，根據(jù)洗脫曲線出現(xiàn)的糖峰為單一對(duì)稱峰，可以判斷HOGS 為分子大小和形狀均一的組分。

2.3 醋酸纖維素薄膜電泳鑒定純度結(jié)果

圖3 醋酸纖維素薄膜電泳圖Fig.3 The acetyl cellulose thin film electrophoresis

采用以pH12.5 的硼酸鹽緩沖液為電泳介質(zhì)，在250 V 電壓下電泳20 min。電泳的結(jié)果如圖3，可以看出醋酸纖維素薄膜上面顯示單一藍(lán)色的條帶，表明所得的糖的組分比較均一。

2.4 HOGS 相對(duì)分子質(zhì)量分布

HOGS 相對(duì)分子質(zhì)量采用凝膠色譜法測(cè)定，如圖4 所示。

圖4 HOGS 凝膠滲透色譜圖Fig.4 GPC spectra of HOGS

結(jié)果表明，示差檢測(cè)器得到的凝膠滲透色譜圖呈正態(tài)分布，多分散系數(shù)Mw/Mn=1.01，HOGS 的相對(duì)分子質(zhì)量峰值Mp 為1 608 D，重均相對(duì)分子質(zhì)量Mw 為1 595 D，數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量Mn 為1 572 D。相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度指數(shù)σn 計(jì)算公式：σ2n=Mn（2Mw/Mn-1）=3.62×104。

HOGS 純品為相對(duì)分子質(zhì)量分布窄的硫酸多糖。

2.5 HOGS 硫酸基團(tuán)表征

KGM、HOG、HOGS 紅外光譜分析如圖5 所示。

圖5 KGM（a）、HOG（b）和HOGS（c）紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of KGM（a）、HOG（b）and HOGS（c）

2.6 HOGS 引入硫酸基團(tuán)位置表征

圖6 HOG 的1H-NMR 譜圖Fig.6 1H-NMR spectra of HOG

圖7 HOGS 的1H-NMR 譜圖Fig.7 1H-NMR spectra of HOGS

引入硫酸基團(tuán)的碳，化學(xué)位移將移向低場(chǎng)約8 ppm，由譜圖6 和譜圖7 對(duì)比可以看出，糖環(huán)質(zhì)子堆積的區(qū)域峰型發(fā)生了變化，部分質(zhì)子信號(hào)移向低場(chǎng)，說明強(qiáng)電負(fù)性的硫酸基團(tuán)的引入，對(duì)糖環(huán)質(zhì)子信號(hào)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致吸電子誘導(dǎo)效應(yīng)的增加，相應(yīng)的質(zhì)子化學(xué)位移值越大，表明在糖環(huán)的C2和C3位的羥基上接有硫酸基團(tuán)。同時(shí)，δ=1.10 ppm 處質(zhì)子吸收峰的積分面積與糖環(huán)上質(zhì)子信號(hào)堆積區(qū)域吸收峰面積之比在硫酸化前后發(fā)生顯著變化，硫酸酯化前約為1 ∶9，硫酸化后約為1 ∶35，表明C6位連接的羥丙基的甲基氫的信號(hào)明顯減弱，說明甲基氫的化學(xué)位移發(fā)生改變，可能受酯化反應(yīng)的影響，在C6位連接的羥丙基上的羥基也發(fā)生了硫酸酯化反應(yīng)，接有硫酸基團(tuán)。

3 討論

多糖混合物純化的方法很多，有鹽析法、金屬絡(luò)合法、親和色譜法、高效毛細(xì)管電泳法、制備性區(qū)域電泳法等。低聚糖的純度標(biāo)準(zhǔn)不能用普通的小分子化合物的純度標(biāo)準(zhǔn)來衡量，因?yàn)榧词故羌兤返牡途厶且泊嬖谖⒂^不均一的問題，其純度只代表某一類糖相似鏈長(zhǎng)的均一組分。HOGS 的純度直接影響其作為功能食品的抗病毒活性，在后續(xù)的研究中，HOGS 的純度與收率是純化工藝的關(guān)鍵。

結(jié)構(gòu)表征結(jié)果表明，HOGS 為相對(duì)分子質(zhì)量分布很窄的低相對(duì)分子質(zhì)量硫酸多糖，其易為機(jī)體吸收的特點(diǎn)能夠更好地發(fā)揮抗病毒活性。FT-IR 顯示分子已連上硫酸基。核磁共振波譜分析表明，硫酸基團(tuán)的連接位置可能在葡萄糖和甘露糖C2、C3和C6位上，符合硫酸多糖抗病毒活性與硫酸基團(tuán)連接位置的構(gòu)效關(guān)系規(guī)律。

鑒于硫酸聚陰離子含量即硫酸基取代度也是抗病毒活性的關(guān)鍵因素；同時(shí)，組成多糖的單糖連接形式對(duì)多糖的構(gòu)象也會(huì)產(chǎn)生影響，從而引起抗病毒活性的改變。因此，后續(xù)結(jié)構(gòu)表征可運(yùn)用X-射線衍射光電子能譜對(duì)HOGS 進(jìn)行表面S 元素定量分析，并結(jié)合高碘酸氧化法分析HOGS 的單糖連接形式，從而進(jìn)一步闡明HOGS 抗病毒的構(gòu)效關(guān)系。

[1]Xiao C B,Weng L H,Zhang L N.Improvements of physical properties of cross linked alginate and carboxymethyl konjac glumannan blend films[J].Journal of Applied Polymer Science,2002,84(13)：2554-2560

[2]Hirohashi N,Vilela S A C.Structural requirements for species specific induction of the sperm acrosome reaction by sea urchin egg sulfated fucan[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2002,298(3)：403-407

[3]熊郃,干信.β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌R10 的產(chǎn)酶特性研究.工業(yè)微生物,2004(3)：42-45

[4]Case S E,Hamann D D.Fracture properties of konjac mannan gel：effect of gel[J].Food hydrocoll,2000,8(2)：147-154

[5]Lehrfeld J.Simultaneous gas-liquid chromatographic determination of aldoses and alduronic acids[J].J Chromatography,2004,408：245

[6]Joung Han Yim,Sung Jin Kim,Se Hoon Ahn,et al.Optimal conditions for the production of sulfated polysaccharide by marine microalga Gyrodinium impudicum strain KG03[J].Bimolecular Engineering,2003,20：273-280

[7]Katsuraya K,Okuyama K,Hatanaka K,et al.Constitution of konjac glucomannan：chemical analysis and 13C NMR spectroscopy[J].Carbohydrate Polymers,2003,53：183-189