單獨(dú)高胃泌素血癥及其與MNNG 合用時對大鼠胃黏膜的影響

李雨文，周麗雅，林三仁，金 珠，鄧 凱

北京大學(xué)第三醫(yī)院消化科，北京 100191

胃癌是嚴(yán)重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤，其致死率在所有惡性腫瘤中居第2 位，僅次于肺癌［1］。在我國，胃癌每年死亡人數(shù)仍位居我國惡性腫瘤的首位，到目前為止，胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不清楚，導(dǎo)致治療效果不盡人意，造成了巨大的社會危害［2］。隨著腫瘤分子生物學(xué)的不斷研究，人們相繼發(fā)現(xiàn)在胃癌［3］、大腸癌［4］、胰腺癌［5］和小細(xì)胞肺癌［6］等腫瘤中均有胃泌素基因的表達(dá)，并在相應(yīng)的細(xì)胞膜表面也發(fā)現(xiàn)有胃泌素的受體。在癌組織及癌旁組織中胃泌素受體陽性表達(dá)率也明顯高于正常組織，提示胃泌素可作為腫瘤臨床診斷與預(yù)后的一項參考指標(biāo)。Michael等［7］指出胃癌患者血清胃泌素水平明顯升高，腫瘤經(jīng)手術(shù)切除后，血清胃泌素明顯下降，術(shù)后當(dāng)腫瘤復(fù)發(fā)時胃泌素水平又再次升高，提示胃泌素的升高可能是胃癌癌前病變的一種征象，可作為鑒別胃良惡性疾病的一個較好的生物學(xué)標(biāo)志物。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染與消化道腫瘤形成的關(guān)系正受到人們的重視，Robertson等［8］認(rèn)為這可能與其誘導(dǎo)的胃泌素水平升高有關(guān)。因此，對胃泌素的研究，有助于臨床上對患者采取合理的治療方式。此外，近年來發(fā)現(xiàn)，長期使用抑制胃酸分泌藥物的患者，胃內(nèi)pH 值升高，減弱了胃竇部G 細(xì)胞的酸抑制作用。于是，G 細(xì)胞大量釋放胃泌素，使患者產(chǎn)生顯著而持久的低酸、高胃泌素血癥，胃泌素又通過與其受體結(jié)合，引起泌酸黏膜的增生，尤其是引起腸嗜鉻樣細(xì)胞(ECL)的過度增殖［9］。但是，長期使用(5～7年)PPIs的患者中，由于腸嗜鉻樣細(xì)胞的增生而發(fā)生胃嗜鉻樣細(xì)胞惡性腫瘤的發(fā)生率高于正常人群的報道卻很少，這使高胃泌素在胃癌發(fā)生中的作用受到了很大的質(zhì)疑［10］。本研究通過單獨(dú)的胃泌素刺激及胃泌素與MNNG 合用時對大鼠胃黏膜的影響，來探索胃泌素在誘發(fā)胃癌中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性Wistar 大鼠24只，體質(zhì)量70 g 左右，北京維通利華實驗動物中心提供［合格證號:SCXK(京)2011-0012］，飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心。大鼠安置在含2.5 cm 厚木屑碎片的聚丙烯籠內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，溫度維持在22℃，12 h 光/暗自動循環(huán)，自動進(jìn)食及飲水。所有動物隨機(jī)分為4組，空白對照組(A組，6只):不做任何處理，自由飲用純凈水;胃泌素組(G組，6只):連續(xù)每天皮下注射胃泌素300μg/kg 共90 d;MNNG組(M組，6只):飲用含MNNG 100μg/ml的自來水;胃泌素與MNNG 合用組(M +G組，6只):飲用含MNNG 100μg/ml的自來水，同時連續(xù)每天注射胃泌素300μg/kg共90 d。

1.2 試劑 胃泌素(皮下注射用)購自Sigma 公司，為白色粉末，使用前用二甲基亞楓(DMSO)配制成濃度為0.4μg/μl的溶液;MNNG 由日本TCI 公司生產(chǎn)，保存于4℃冰箱。含MNNG的飲用水在使用前配制以防止其分解。飲水瓶外用錫箔紙包裹，用以避光;兔抗大鼠ki-67(增殖細(xì)胞核抗原)多克隆抗體購自Epitomics 公司;兔抗大鼠bcl-2(即B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因)多克隆抗體購自Bioworld 公司，二抗兔/鼠通用型抗體和DAB(二氨基聯(lián)苯胺或聯(lián)苯二胺3，3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)顯色液均購自Dako公司。

1.3 動物標(biāo)本取材和染色 實驗第90 天取材，處死前，大鼠禁食24 h，用2.5%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)腹腔注射麻醉動物，打開動物腹腔，取出大鼠胃組織，沿胃大彎切開，生理鹽水清洗干凈后，把標(biāo)本固定于泡沫板上，肉眼觀察胃黏膜大體形態(tài)變化，隨后將胃組織固定于10%的中性甲醛溶液中，固定24 h 后，標(biāo)本常規(guī)取材，每只動物在胃體、胃竇各取材兩塊，經(jīng)組織脫水透明、浸蠟、包埋、切片(厚度5μm)，進(jìn)行HE 染色，觀察胃黏膜的組織病理學(xué)變化，并且在5 倍光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機(jī)取10 處，測量胃泌酸區(qū)黏膜層的厚度，取其平均值(μm)。

1.4 大鼠胃組織免疫組織化學(xué)染色 上述石蠟切片，分別作bcl-2 抗體(1∶300)和ki-67 抗體(1∶300)的免疫組化染色，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)代替一抗作為陰性對照，用公司提供的陽性反應(yīng)組織作為陽性對照。具體步驟參照操作說明書進(jìn)行。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):①bcl-2 抗體陽性反應(yīng)物主要位于細(xì)胞胞漿，凡細(xì)胞漿中出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為蛋白陽性細(xì)胞;②ki-67 定位于細(xì)胞核及有絲分裂細(xì)胞胞質(zhì)，凡細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒為陽性。每張切片按一定距離觀察10個高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)分析。將上述免疫組織化學(xué)結(jié)果用Image-Pro-Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，細(xì)胞計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 本實驗所有數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理。計量資料采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 M組和M +G組兩組大鼠與對照組比較明顯不活潑，食量減少;兩組大鼠毛發(fā)松散，光澤度差，活動減少;G組和空白對照組比較無明顯差異。

2.2 HE 染色 光鏡觀察組織細(xì)胞的排列方式、層數(shù)、腺細(xì)胞大小、細(xì)胞的異型性、胞核、核漿比有無異常、是否有癌細(xì)胞等。各組動物胃均未見異常。

2.3 4組大鼠胃黏膜厚度比較 A組、G組、M組和M+ G組的胃黏膜層厚度分別為:(785.43±98.3)μm、(964.70± 170.5)μm、(713.50± 92.3)μm、(817.68±109.5)μm。4組動物胃體黏膜層厚度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，G組及M +G組動物與A組、M組相比，胃體黏膜層增加(見圖1)。

圖1 4組大鼠胃體HE 染色圖(50×) A:A組;B:G組;C:M組;D:M+G組Fig 1 The gastric mucosa of four groups (50×) A:A group;B:G group;C:M group;D:M+G group

2.4 bcl-2、ki-67 在4組胃組織中的表達(dá) 2種抗體在4組胃組織中的表達(dá)見表1。bcl-2 抗體陽性反應(yīng)物主要位于胞漿，呈棕黃色顆粒，經(jīng)蘇木素復(fù)染后胞核呈藍(lán)色。方差分析，各組中bcl-2 含量有差別，其中A組與G組、M組、M +G組的組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

ki-67 抗體陽性反應(yīng)物主要位于胞核，呈棕黃色顆粒樣沉淀，陰性反應(yīng)胞核經(jīng)蘇木素復(fù)染后呈藍(lán)色。然后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，細(xì)胞計數(shù)。方差分析，各組中ki-67 含量有差別，其中A組與G組、M組、M+G組的組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見圖2～3)。

表1 bcl-2及ki-67 在4組胃組織中的表達(dá)()Tab 1 The expression of bcl-2 and ki-67 in gastric tissues of four groups()

表1 bcl-2及ki-67 在4組胃組織中的表達(dá)()Tab 1 The expression of bcl-2 and ki-67 in gastric tissues of four groups()

注:與A組相比，* P＜0.05。

圖2 4組大鼠胃竇bcl-2 免疫組化染色圖(200×);圖3 4組大鼠胃竇ki-67 免疫組化染色圖(200×) A:A組;B:G組;C:M組;D:M+G組Fig 2 The expression of bcl-2 in four groups (immunohistochemical staining，200×);Fig 3 The expression of ki-67 in four groups (immunohistochemical staining，200×) A:A group;B:G group;C:M group;D:M+G group

3 討論

胃泌素由分布于胃竇和十二指腸近端的G 細(xì)胞分泌，釋放貯存于血液、組織和胃腸液當(dāng)中，起著循環(huán)激素和神經(jīng)遞質(zhì)的雙重作用，除了可以刺激壁細(xì)胞和主細(xì)胞而促進(jìn)胃酸、胃蛋白酶分泌外，還可以促進(jìn)胃腸黏膜細(xì)胞的分裂增殖，增加DNA、RNA的合成和蛋白質(zhì)的含量，并且可以營養(yǎng)胃腸道黏膜及壁細(xì)胞群，促進(jìn)胃腸道黏膜的生長和加快黏膜更新速度等;還能增加胃黏膜血流量，有利于損傷組織的修復(fù);還能促進(jìn)胃竇運(yùn)動，加速胃排空等［11］。近年來，由于抑制胃酸藥物的廣泛應(yīng)用，其產(chǎn)生的高胃泌素血癥的影響也越來越受到人們的關(guān)注。因此對高胃泌素血癥的研究，有助于臨床上對患者采取合理的治療方式。

MNNG 是一種較為常見的引起癌變的活性致癌劑，它不依賴酶的代謝而直接作用于胃腸道黏膜上皮，使DNA 鏈上已有的堿基發(fā)生烷化產(chǎn)生突變，發(fā)揮其致癌作用［12］，它可誘發(fā)大鼠實驗性胃癌，現(xiàn)已得到公認(rèn)，本研究由于給藥時間較短，并未誘導(dǎo)出胃癌。

bcl-2 是一種凋亡抑制基因，在腫瘤細(xì)胞的增殖中起重要作用，它是由Tsujimoto等［13］在人類濾泡型淋巴瘤研究中首先發(fā)現(xiàn)而命名，定位于人染色體18q21，長約230 000 bp［14］。bcl-2 蛋白是通過染色體內(nèi)的轉(zhuǎn)位活化而致其編碼的蛋白產(chǎn)物過度表達(dá)，位于線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，主要通過抑制細(xì)胞色素C從線粒體向胞質(zhì)釋放，延長細(xì)胞壽命，從而阻斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本實驗結(jié)果表明:無論是單獨(dú)胃泌素組，MNNG組或者是兩者共同作用時，bcl-2的表達(dá)均升高，且與空白組比較，其升高差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示高胃泌素血癥與細(xì)胞凋亡相關(guān)，能抑制細(xì)胞凋亡。凋亡減少導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞存活更長時間，累積了致癌物。在癌前病變中亦可見異常的bcl-2 表達(dá)，且這一異常持續(xù)至癌癥形成的整個過程中［15-16］。Kidd等［17］報道用洛克替丁處理動物后，內(nèi)源性高胃泌素導(dǎo)致細(xì)胞增生/凋亡比例明顯高于對照組和停藥組，腺體中bcl-2的表達(dá)升高而Bax的表達(dá)則下降，提示高胃泌素與細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。

ki-67 是一種人類增殖細(xì)胞核抗原，通過測定細(xì)胞ki-67的表達(dá)，可以了解細(xì)胞的增殖情況。一般認(rèn)為細(xì)胞呈現(xiàn)高增殖狀態(tài)時，更容易形成腫瘤［18］。本實驗結(jié)果表明:無論是單獨(dú)胃泌素組、MNNG組或者是兩者共同作用，ki-67的表達(dá)升高，且與空白組比較，其升高差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示高胃泌素血癥能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。胃泌素與其受體結(jié)合后通過細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)可以促進(jìn)某些原癌基因如c-myc、c-fos 以及細(xì)胞周期蛋白cyclinD1等的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，以促進(jìn)胃腸道腫瘤細(xì)胞增殖。腫瘤細(xì)胞本身就能分泌釋放胃泌素，同時又表達(dá)胃泌素受體，腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的胃泌素與其自身的受體結(jié)合后，刺激腫瘤細(xì)胞的生長［19］。增殖的細(xì)胞更容易形成癌癥，是因為內(nèi)源性或者外源性致癌物增加了細(xì)胞內(nèi)致癌物的累積。Gerdes［20］的研究也表明ki-67 抗原表達(dá)可反映腫瘤細(xì)胞的增生活性，與惡性腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移與預(yù)后高度相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示:G組動物出現(xiàn)了黏膜層增厚，提示胃泌素能促進(jìn)胃黏膜生長，使黏膜層增厚。對高胃泌素血癥的卓－艾氏綜合征患者進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查和細(xì)胞增殖動力學(xué)的研究，結(jié)果表明長期高胃泌素血癥可以促進(jìn)腸道黏膜過度的增生而引起組織黏膜癌變［21］。胃泌素能促進(jìn)胃黏膜生長增厚并且增加了ki-67及bcl-2的表達(dá)量，提示單獨(dú)高胃泌素血癥有可能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡而最終導(dǎo)致腫瘤的形成。

目前，臨床上常用的PPIs 類藥物和H2－受體拮抗劑均可能在抑酸的同時導(dǎo)致胃泌素水平升高，胃食管反流病發(fā)病率的升高也會使這兩類藥物的使用增加。而且中國又是H.pylori 感染高發(fā)的國家，H.pylori的感染會進(jìn)一步升高胃泌素的水平。對胃泌素及其受體的研究將為這兩類藥物使用期限、年齡范圍，以及在使用前是否需要根除H.pylori，使用期間是否需要進(jìn)行隨訪等，給予一定的臨床指導(dǎo)意義。

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