尾懸吊模擬失重對大鼠血清GAS 含量和胃黏膜Hsp70及其基因表達(dá)的影響

郭 彪，李正鵬，楊建武，周金蓮，楊鶴鳴，董滿庫，王 平，張宏文，李成林，崔 彥

1.安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍306 臨床學(xué)院普通外科，北京 100101;2.解放軍第306 醫(yī)院普通外科;3.解放軍第306 醫(yī)院病理科

進(jìn)入21 世紀(jì)以來，我國載人航天事業(yè)飛速發(fā)展，探索和明確失重狀態(tài)下航天員機體各器官系統(tǒng)的變化愈加緊迫和重要［1］。研究已證實，微重力狀態(tài)會導(dǎo)致心血管功能障礙、骨質(zhì)丟失、肌肉萎縮、免疫能力下降、內(nèi)分泌功能紊亂及空間運動病等多種病理生理的改變，但對消化系統(tǒng)尚缺乏系統(tǒng)研究［2］。胃是機體最大的消化和分泌器官之一，了解失重對胃黏膜結(jié)構(gòu)及功能造成的應(yīng)激影響有重要意義。本文研究尾懸吊模擬失重環(huán)境對大鼠血清胃泌素(gastrin，GAS)含量、腺胃區(qū)胃黏膜組織中熱休克蛋白70(heat shock protein 70，Hsp70)及其基因表達(dá)的變化，探討胃黏膜組織對尾懸吊模擬失重的應(yīng)激反應(yīng)特點，為航天員的醫(yī)監(jiān)醫(yī)保提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后進(jìn)行動物實驗。采用SPF級健康成年雄性Wistar 大鼠64只，體質(zhì)量(200±20)g，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗研究所提供。經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗，按隨機數(shù)字表法將實驗大鼠分為8組(n=8)，分別為懸尾6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d和0 h(地面對照組)。

1.2 動物模型與取材 采用尾吊法建立模擬失重動物模型［3］。大鼠單籠飼養(yǎng)，實驗組大鼠尾部懸于籠頂，前肢踏于籠底，呈－30°頭低位;對照組大鼠置于相同鼠籠中。動物飼養(yǎng)條件為人工控溫(23±2)℃，保持12 h 光照與黑暗交替循環(huán)，均可自由活動、飲水采食。各實驗組結(jié)束時，腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)將動物麻醉，無菌操作，經(jīng)腹正中線剖腹，顯露下腔靜脈抽取血樣本，切取腺胃區(qū)胃黏膜組織兩份，一份超低溫保存于液氮罐中，另一份浸于4%多聚甲醛(pH 7.4)中固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.3 放免法檢測大鼠血清GAS 含量 靜脈血4℃過夜，離心3 000 r/min×10 min，分離血清，－80℃冰箱保存。血清GAS 含量采用放射免疫法測定，碘(125I)胃泌素放射免疫分析藥盒［Iodine (125I)Gastrin Radioimmunoassay Kit］購自北京北方生物技術(shù)研究所，具體操作步驟按試劑盒說明書及相關(guān)步驟進(jìn)行。

1.4 免疫組化法檢測大鼠胃黏膜組織中Hsp70 表達(dá) (1)取石蠟包埋的胃黏膜組織，4μm 切片，常規(guī)脫蠟水化;(2)3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶20 min，TCA 溶液微波抗原修復(fù)4 min×4次，冷卻至室溫;(3)10%羊血清室溫下孵育1 h，封閉非特異性抗原;(4)稀釋Hsp70 多克隆抗體(BA0928，武漢博士德生物工程有限公司)，PBS 代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜，PBS 洗5 min×3次;(5)加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(Zymed，USA)，常溫下孵育3 h，PBS洗5 min×3次;(6)滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(Zymed，USA)，37℃溫箱中孵育30 min，PBS洗滌5 min×5次;(7)DAB 顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察攝像;(8)Hsp70 結(jié)果判定:以細(xì)胞核和(或)胞漿中有明顯的棕黃色顆粒為陽性。Image-Pro Plus 7.0 圖像處理軟件對Hsp70的表達(dá)進(jìn)行定量分析，測定免疫組化照片光密度值，計算平均光密度值(mean density=IOD SUM/area)的高低來反映Hsp70蛋白表達(dá)量的變化。IOD(integrated optical density)SUM為免疫組化照片陽性著色(棕黃色)的累積光密度值，area為整個照片區(qū)域的面積。以每組(n=8)平均光密度的平均值作為該組的測量值。

1.5 RT-PCR 檢測大鼠胃黏膜組織中Hsp70 mRNA表達(dá) 取液氮罐中保存的胃黏膜組織，用Trizol 法(美國Inventory 公司)提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)檢測胃黏膜組織中Hsp70 mRNA 表達(dá)，引物序列(根據(jù)Genebank 設(shè)計)、循環(huán)條件和擴增片段長度見表1。PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用Gel Image System 凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，應(yīng)用AlphaImger 2200 software對擴增產(chǎn)物進(jìn)行表達(dá)強度分析，以Hsp70 mRNA/GAPDH 灰度值比值作為Hsp70 mRNA的相對表達(dá)水平。

表1 PCR 引物序列、循環(huán)條件和擴增片段長度Tab 1 PCR primer sequence，reaction condition and amplified fragment length

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用表示，多個樣本的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物觀察 本實驗過程中無實驗動物死亡現(xiàn)象。尾懸吊初始，大鼠躁動不安，部分大鼠眼結(jié)膜有充血現(xiàn)象;懸吊1 d 時，動物轉(zhuǎn)為精神萎靡，飲食較對照組減少，稀便排泄物增多;懸吊2～3 d 以后各組大鼠逐漸恢復(fù)平靜，飲食、飲水逐漸恢復(fù)。懸吊1 d、2 d和3 d組大鼠的體質(zhì)量較懸吊前下降(P＜0.05，見表2)。

2.2 大鼠血清GAS 含量 與對照組相比，實驗組大鼠血清GAS 含量(pg/ml)在模擬失重早期(6～12 h)明顯升高(55.73±4.86 vs 64.99±4.95、67.73±3.66，P＜0.05)。隨著尾懸吊時相的延長，血清GAS 含量呈逐漸下降趨勢，5 d(55.16±2.92)時與對照組水平相近，之后繼續(xù)下降，7 d的GAS 含量(48.73±2.99)低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 尾懸吊模擬失重大鼠體重變化(g，)Tab 2 Changes of rats weight under simulated weightlessness(g，)

表2 尾懸吊模擬失重大鼠體重變化(g，)Tab 2 Changes of rats weight under simulated weightlessness(g，)

注:與尾懸吊前比較，* P＜0.05。

2.3 免疫組化檢測結(jié)果 Hsp70 陽性表達(dá)著色為棕褐色。實驗各組大鼠胃黏膜組織中均有Hsp70 陽性表達(dá)。懸吊6 h～2 d各組大鼠胃黏膜組織中著色明顯變深，尤其胞核在模擬失重早期即深染，期間胞漿染色亦增強(見圖1A、1B);懸吊3～7 d組大鼠的胞核染色又逐漸變淺，部分胞核中染色消失，但細(xì)胞漿內(nèi)仍有比較明顯的Hsp70 染色(見圖1C、1D);對照組僅胞質(zhì)有弱表達(dá)，胞核無表達(dá)(見圖1E、F);陰性對照圖組胃黏膜組織細(xì)胞胞核和胞漿中均未見著色(見圖1G、1H)。各實驗組平均光密度值的變化表現(xiàn)為:尾懸吊6 h組Hsp70 蛋白表達(dá)水平(0.2229±0.0073)顯著升高，12 h(0.2034±0.0091)、1 d(0.1994±0.0076)、2 d(0.1735±0.0057)組的Hsp70 蛋白持續(xù)高表達(dá)，與對照組(0.1137±0.0051)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);模擬失重3 d 后Hsp70 表達(dá)水平(0.1394±0.0083)下 降 較 明 顯;3 d組、5 d組(0.1307±0.0043)、7 d組(0.1158±0.0069)大鼠的Hsp70 表達(dá)水平與對照組基本相同，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 尾懸吊模擬失重大鼠胃黏膜組織中Hsp70 表達(dá)情況 A～B:6 h組;C～D:3 d組;E～F:對照組;G～H:陰性對照組Fig 1 Hsp70 expression in gastric mucosa of tail-suspended rats A～B:suspension for 6 h;C～D:suspension for 3 d;E～F:suspension for 0 h;G～H:negative control

2.4 RT-PCR 檢測結(jié)果 檢測結(jié)果表明，模擬失重各組及對照組大鼠胃黏膜組織中均有Hsp70 mRNA 表達(dá)(見圖2)，表現(xiàn)為早期上升后期回落的特點。模擬失重6 h 大鼠胃黏膜組織中Hsp70 mRNA 表達(dá)水平即明顯上調(diào)，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。12 h、1 d、2 d各組的Hsp70 mRNA 表達(dá)逐漸回落，3 d組降至接近對照組水平，其后又出現(xiàn)一短時相升高現(xiàn)象(見圖3)。

圖2 RT-PCR 分析模擬失重大鼠胃黏膜組織中Hsp70 mRNA表達(dá)水平變化Fig 2 Hsp70 mRNA were detected in gastric mucosa of both suspended and control rats by RT-PCR analysis

圖3 半定量RT-PCR 顯示各組大鼠胃黏膜組織中Hsp70/GAPDH mRNA的灰度比值Fig 3 The semi-quantitative RT-PCR analysis showed the features of Hsp70 mRNA expression in gastric mucosa tissue of both suspended and control rats

3 討論

胃腸道功能龐大而復(fù)雜，微重力環(huán)境下的胃腸生理病理學(xué)研究，一直是一個焦點和難點問題［2］。本實驗檢測尾懸吊模擬失重大鼠胃黏膜中Hsp70及其基因表達(dá)的變化，研究失重對胃黏膜造成的應(yīng)激反應(yīng)特點。Hsp70 是最重要的應(yīng)激反應(yīng)分子伴侶，參與應(yīng)激情況下細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、運輸、降解及調(diào)節(jié)等一系列過程，其表達(dá)水平與組織細(xì)胞損傷及自身保護(hù)能力密切相關(guān)，并具有雙刃劍樣作用［4］。失重環(huán)境下胃黏膜組織中Hsp70 表達(dá)的相關(guān)研究尚未見文獻(xiàn)報道。根據(jù)胃黏膜組織的不同，大鼠的胃分為皮區(qū)(cutaneous zone)和腺區(qū)(glandular zone)兩部分，皮區(qū)上皮的角化與食管相似，腺區(qū)黏膜為單層柱狀上皮，充滿腺體。本研究免疫組化結(jié)果顯示，模擬失重大鼠胃黏膜組織中Hsp70 表達(dá)呈現(xiàn)早期上升后期回落并有波動的特點;RT-PCR 結(jié)果顯示，大鼠胃腺區(qū)胃黏膜組織中Hsp70 mRNA 表達(dá)有類似的先升高后降低的變化特點，與Hsp70的表達(dá)變化既有同步趨勢，又有一定差異性，分析這種差異產(chǎn)生的原因，可能一方面符合基因轉(zhuǎn)錄激活先于下游蛋白合成的規(guī)律，同時是否存在應(yīng)激原對Hsp70 mRNA 上下游基因信號調(diào)控和對Hsp70 mRNA前體影響的特殊機制，尚需要進(jìn)一步研究。尾懸吊大鼠胃腺區(qū)Hsp70及其基因表達(dá)變化的特點，充分說明Hsp70 參與了模擬失重大鼠胃黏膜的應(yīng)激反應(yīng)，并在應(yīng)激反應(yīng)及失重耐受形成過程中可能發(fā)揮重要作用。胃黏膜應(yīng)激反應(yīng)發(fā)展到一定程度上，直接的后果是應(yīng)激性潰瘍。航天員地面模擬失重訓(xùn)練乃至航天飛行過程中，胃黏膜應(yīng)激反應(yīng)情況是一個值得受到關(guān)注的問題。根據(jù)Hsp70 既具雙刃劍樣作用又有交叉耐受和記憶功能的特性［4］，理論上可以認(rèn)為，失重及各種非失重應(yīng)激原誘導(dǎo)表達(dá)的Hsp70 在一定程度上均能提高失重應(yīng)激耐力，這與航天員通過地面模擬失重訓(xùn)練以期提高失重耐力的實際情況相吻合。這種機制在失重強化訓(xùn)練過程中的作用并加以充分利用極具重要的現(xiàn)實意義。

失重環(huán)境是一種特殊的應(yīng)激原，可導(dǎo)致機體在局部和整體上均產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)。研究證實，失重可激活下丘腦－垂體－腎上腺軸及交感、副交感神經(jīng)系統(tǒng)，而人體胃腸道激素的分泌受中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)［5］。本研究在觀察尾懸吊模擬失重對胃黏膜應(yīng)激效應(yīng)的同時檢測血清GAS 含量變化。GAS 又稱促胃液素，是一種最早為人們所認(rèn)識的胃腸肽類激素，主要由胃竇及十二指腸近端黏膜的G 細(xì)胞分泌，具有促進(jìn)胃酸和胃蛋白酶原分泌等生理功能。本研究發(fā)現(xiàn)，在模擬失重早期大鼠血清GAS 含量明顯升高，而隨著尾懸吊時相的延長，血清GAS 含量呈逐漸下降趨勢，7 d 時的GAS 含量低于對照組，這與Riepl等［6］的研究結(jié)果近似。分析認(rèn)為，在應(yīng)激狀態(tài)下GAS 表達(dá)量升高，將導(dǎo)致胃酸和胃蛋白酶分泌增多，可能會影響胃黏膜，促發(fā)消化性潰瘍的形成。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，模擬失重環(huán)境可降低大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)再生，延遲大鼠實驗性胃潰瘍的愈合［7］，這也從另一角度印證了模擬微重力可影響胃黏膜屏障功能。但也有研究表明，GAS 還具有增加胃腸黏膜細(xì)胞DNA、RNA 合成及胃黏膜血流量，促進(jìn)黏膜生長的作用［8］。顯然，GAS對胃黏膜的多重作用及調(diào)節(jié)機制尚有待深入研究。實驗動物在失重暴露急性期后，血清GAS的下降應(yīng)屬于機體的一種適應(yīng)性變化，而較長時間失重環(huán)境下血清GAS的變化規(guī)律及機制和意義亦需進(jìn)一步研究。

綜上所述，尾懸吊模擬失重環(huán)境中的大鼠，無論其血清GAS 含量的波動，還是胃黏膜腺區(qū)Hsp70 表達(dá)的變化，均提示在尾懸吊早期胃黏膜屏障會受到源自局部和全身性的應(yīng)激因素的損傷，而在失重暴露急性期以后機體則可通過各種機制對失重得以適應(yīng)。這種多因素多層面相互作用和時相不同特點各異的具體機制，意義深遠(yuǎn)，有待深入探討。

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