香草醛-硫酸測定甘草浸膏中甘草酸含量

張慧慧，劉明言，凌寧生

（1天津大學化工學院，天津 300072；2天津中新藥業(yè)集團股份有限公司中新制藥廠，天津 300457）

甘草為豆科（Leguminosae）甘草屬（Glycyrrhiza）植物，主要有效成分為三萜化合物、黃酮類和多糖化合物等[1-6]。甘草酸是甘草的根和根莖中所含的一種五環(huán)三萜皂苷，具有抗炎、抗氧化、抑菌等作用[2]，但過量服用甘草酸可能引起鈉潴留和高血壓[3]。甘草中含有多類有效成分，甘草提取物多是利用甘草酸。為了節(jié)約資源，需對提取甘草酸后的殘余成分開展利用研究。大多研究為對提取完甘草酸后甘草渣的利用，但是尚未見到從提取完甘草多糖后的甘草浸膏中提取甘草酸的研究報道。

目前，甘草酸含量測定方法主要有：重量法、比色法、紫外分光光度法、薄層掃描法[4]、高效液相色譜法[5]及毛細管電泳法[6]等。高效液相色譜和毛細管電泳法精確度高，但成本高，更適用于較少甘草酸含量的測定。比色法在測定皂苷類成分含量方面仍比較常見，魚紅閃等[7]、張恩淑[8]利用香草醛-硫酸法測定甘草酸含量時，均用乙醇溶液溶解顯色劑進行直接測定，但劉芃巖等[9]研究發(fā)現(xiàn)甲醇、乙醇等溶劑對該法顯色有很大干擾。張中偉等[10]研究發(fā)現(xiàn)香草醛-高氯酸法作為三萜皂苷常用的顯色劑，較香草醛-硫酸法精密度高，受糖類干擾小，蘭霞等[11]利用香草醛-高氯酸法測定甘草中總皂苷的含量，并對該方法進行了條件的優(yōu)化和方法學考察，但該法需要用到冰乙酸和高氯酸兩種溶劑。從提取完甘草多糖后的甘草浸膏中提取分離甘草酸，由于涉及的甘草浸膏不含糖類的特性以及所用的分離方法為流化床，重點考察的是含量的變化趨勢，所以本研究主要對文獻中香草醛-硫酸法進行改進，旨在建立一種簡便、準確的甘草提取完糖類后浸膏中甘草酸含量的測定方法。

1 實驗材料

UV759系列紫外-可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；AUY120型分析天平，SHIMADZU公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市精達儀器制造廠。

甘草酸標準品（99.21% UV，75% HPLC，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司），甘草浸膏（天津中新藥業(yè)集團股份有限公司中新制藥廠甘草提取糖類后的浸膏），無水乙醇、香草醛、濃硫酸（98%）（均為分析純，天津市江天化工廠）。

2 實驗方法

稱取 0.0333 g甘草酸標準品（實際含甘草酸0.025 g），溶于25 mL 25%乙醇，80 ℃水中微熱，配制成1.0 mg/mL的甘草酸標準品溶液。

2.1 最大波長的確定

準確吸取0.25 mL標準品溶液，在80 ℃水浴中揮去乙醇，冷卻，加入0.25 mL 5 mg/mL香草醛溶液（0.15 g香草醛溶于30 mL蒸餾水中，80 ℃水中微熱溶解，新鮮配制），放入冷水中，加入2.50 mL 78%硫酸，搖勻，在60 ℃水浴中加熱20 min，迅速冷卻至室溫，以0.25 mL蒸餾水代替試樣液為空白對照，進行400～600 nm波長掃描。

2.2 比色條件的優(yōu)化

通過對影響顯色的因素（香草醛濃度、硫酸濃度、硫酸用量、時間、溫度）進行考察，得到最優(yōu)的比色條件。

方法：取0.25 mL 標準品溶液，80 ℃水浴中揮去乙醇，冷卻后，加入新鮮配制的0.25 mL不同濃度的香草醛溶液，放入冷水中，加入不同體積濃度及不同體積的硫酸溶液，搖勻，在不同溫度水浴中加熱不同時間，迅速冷卻至室溫，進行吸光度的測定。

2.3 方法學的考察

2.3.1 顯色穩(wěn)定性

在最佳顯色條件下，進行顯色反應，設置紫外分光光度計在1 h內(nèi)每隔1 min測定一次顯色后溶液的吸光度。

2.3.2 標準曲線的制備

配制不同濃度的甘草酸標準品溶液：0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL，各取0.25 mL，按最佳顯色條件進行顯色，以吸光度A為橫坐標，甘草酸濃度c為縱坐標，繪制標準曲線。

2.3.3 精密度的測定

將0.025 g干燥的甘草浸膏，溶于25 mL 25%乙醇中，80 ℃水中微熱，得到樣品待測液。吸取相等體積樣品待測液6份，按最佳顯色反應條件進行顯色測定吸光度，按標準曲線計算甘草酸含量，通過相對標準偏差RSD評價精密度。

2.3.4 加樣回收率

吸取5 mL樣品待測液5份，分別加入1 mL的0.50 mg/mL、0.75 mg/mL、1.00 mg/mL、1.25 mg/mL、1.50 mg/mL甘草酸純品，搖勻，按最佳顯色反應條件進行顯色測定吸光度，通過標準曲線得到甘草酸含量，對能檢測到的甘草酸純品進行回收率考察，得到平均回收率，并通過RSD對結(jié)果進行評價。

3 結(jié)果與討論

3.1 最大波長的確定

香草醛-硫酸是測定三萜皂苷含量常用的一種顯色劑，反應原理即甘草酸在濃硫酸作用下脫氫，與香草醛加成形成特征性的紅色絡合物[10]，通過紫外可見分光光度計進行含量的測定。采用前述顯色方法，掃描后的最大吸收波長為535 nm。

3.2 比色條件的優(yōu)化

3.2.1 最佳香草醛濃度的確定

結(jié)果如圖 1，隨著香草醛濃度的增加，吸光度增加，大于7 mg/mL濃度雖然顯色更好，但實驗中發(fā)現(xiàn)重復性差，所以選擇6 mg/mL濃度香草醛溶液進行顯色反應。

圖1 香草醛濃度對顯色反應的影響

3.2.2 最佳硫酸濃度的確定

采用 45%、50%、55%的硫酸進行實驗，未發(fā)生顯色反應，這是因為這些濃度的硫酸不具有足夠的氧化性，這也間接證明了該顯色反應中硫酸的作用主要是氧化作用。從圖2中可以看出，75%硫酸用于顯色效果較好。但是隨著硫酸濃度的繼續(xù)增加，吸光度開始下降，這是由于過高濃度的硫酸會引起香草醛自身縮合反應[12]，導致與甘草酸反應的香草醛減少從而使產(chǎn)物減少。

圖2 硫酸濃度對顯色反應的影響

3.2.3 最佳硫酸用量的確定

不同的硫酸用量，對顯色反應具有一定的稀釋作用，相比反應體系的體積，硫酸的稀釋作用對測定結(jié)果有較大影響，故對吸光度值進行了校正，即乘以體積相對系數(shù)，排除稀釋作用的影響。圖3顯示，2.0 mL硫酸加入量顯色效果較佳。隨著硫酸用量的增加，溶液pH值降低，甘草酸的溶解度降低，吸光度減少。

3.2.4 最佳顯色溫度的確定

從圖4可知，吸光度隨著溫度的升高逐漸增加，75 ℃之后基本穩(wěn)定，故選擇在 75 ℃進行顯色反應。

3.2.5 最佳顯色時間的確定

圖5顯示，隨著反應時間的增加，吸光度逐漸增加，在 25 min反應基本完成，故選擇顯色反應25 min即可。

通過對比色條件的影響因素的考察，得到最佳的比色條件：0.25 mL待測液，進行預處理，加入0.25 mL濃度為 6 mg/mL香草醛溶液和2.0 mL 75%硫酸，在75 ℃反應25 min，在該條件下顯色，效果最好。

3.3 方法學的考察

3.3.1 顯色穩(wěn)定性

吸光度測定值RSD=1.093%，表明顯色反應在1 h內(nèi)基本穩(wěn)定，可以滿足測定的要求。

圖3 硫酸用量對顯色反應的影響

圖4 溫度對顯色反應的影響

圖5 顯色時間對顯色反應的影響

3.3.2 標準曲線

在最佳顯色條件（0.25 mL 6 mg/mL香草醛溶液和2.0 mL 75%硫酸，75 ℃反應25 min）下顯色，通過吸光度的測定，得到回歸曲線數(shù)據(jù)（見表1）。如圖6所示，標準曲線方程為：C=0.1517A–0.0078，R2=0.9996，在0.0200～0.1000 mg/mL范圍內(nèi)，線性相關(guān)性較好。

3.3.3 精密度的測定

精密度測定結(jié)果見表2。

吸光度RSD=4.39% ,表明該方法測定甘草酸含量重現(xiàn)性較好。

3.3.4 加樣回收率

如表3所示，平均回收率X=95.93%，RSD=4.62%，可以保證最終測定結(jié)果的可靠性。

表1 測定的回歸曲線數(shù)據(jù)

圖6 甘草酸的標準曲線

表2 精密度實驗結(jié)果

表3 加樣回收率實驗結(jié)果

3.3.5 甘草酸粗品的制備與含量測定

取甘草干浸膏5 g，加入100 mL水，25 ℃磁力攪拌溶解，緩慢滴加50%硫酸，至溶液的pH=2，靜置，抽濾得到沉淀，進行兩相系統(tǒng)分離[13]（乙醇∶K2HPO4∶水=548 g∶137 g∶365 g）, 25 ℃磁力攪拌溶解，靜置24 h，取上層清液，滴加50%硫酸至不再有沉淀析出，抽濾，烘干，得到甘草酸粗品。取干燥后的甘草酸粗品0.2319 g，溶于100 mL 25%乙醇溶液，分別取0.25 mL 置于80 ℃水浴中加熱1 h，待其冷卻至室溫，加入0.25 mL 6.0 mg/mL香草醛水溶液，置于冰水中加入2.0 mL 75%硫酸，取出，待其恢復室溫，在 75 ℃水浴中進行顯色反應25 min，在535 nm處測定吸光度，按標準曲線計算甘草酸含量，結(jié)果顯示甘草酸粗品平行樣中甘草酸純度分別為6.87%、6.85%、6.94%，平均值為6.89%。

4 結(jié) 論

本研究方法主要用于甘草提取甘草多糖后浸膏中甘草酸含量的測定及變化趨勢考察。通過對影響香草醛-濃硫酸方法影響因素的考察發(fā)現(xiàn)，0.25 mL待測液中加入0.25 mL 6 mg/mL香草醛溶液和2.0 mL 75%硫酸，在75 ℃反應25 min，顯色效果最好。由于實驗所用甘草浸膏中不含有糖類物質(zhì)，該方法精密度可以得到較好的提高。在最佳顯色條件下對該法進行方法學考察也發(fā)現(xiàn)，該法顯色穩(wěn)定、樣品精密度和重復性都較好，可以滿足測定要求。同時，該方法只需一種顯色溶劑，相比香草醛-高氯酸法，操作更簡便。

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