羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)百里香揮發(fā)油包合作用的研究

馬君義，王寶生，黃玉龍，王曼婷，張 繼

(1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州 730070;2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730070)

百里香(Thymus mongolicus Ronn.)為唇形科百里香屬多年生草本植物，是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織1970年公布并被世界許多國(guó)家承認(rèn)的食物香辛料之一，具有祛風(fēng)解表、行氣健脾、溫中止痛、殺菌驅(qū)蟲的功效。百里香兼有較高的食用、藥用和化工應(yīng)用價(jià)值，可作為肉醬、香腸、腌肉和泡菜的綠色無(wú)害的香料添加劑，同時(shí)還有香化、蜜源、綠化觀賞和環(huán)保等作用，是一種開(kāi)發(fā)潛力較大的芳香植物。百里香揮發(fā)油具有抗菌、消炎止痛、抗氧化、抗腫瘤、防止血栓形成、治療關(guān)節(jié)炎以及減緩身體器官組織衰老等重要的藥理作用［1－8］。但百里香揮發(fā)油性質(zhì)不穩(wěn)定，易揮發(fā)，易氧化變質(zhì)，使其應(yīng)用受到限制。國(guó)內(nèi)已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道采用β－環(huán)糊精(β－CD)包合技術(shù)成功的制備了百里香揮發(fā)油β－CD包合物，包合后的百里香揮發(fā)油包合物可溶于水，穩(wěn)定性提高，并提高了生物利用度［9－11］。但由于 β－CD 的水溶性較小，且具有溶血等不良反應(yīng)，而羥丙基－β－環(huán)糊精(HP－β－CD)不僅水溶性高，增溶效果顯著，且腎毒性、溶血作用及刺激性均較?。?2］，被認(rèn)為是極有潛力的低毒、安全、有效的增溶劑。本研究通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)和綜合評(píng)分對(duì)HP－β－CD包合百里香揮發(fā)油工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用傅立葉變換紅外光譜(FT－IR)對(duì)包合物進(jìn)行表征，并利用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(GC－MS)技術(shù)對(duì)比分析了包合前后百里香揮發(fā)油的化學(xué)成分，為百里香揮發(fā)油的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百里香 采自甘肅省臨潭縣，經(jīng)西北師范大學(xué)植物研究所廉永善研究員鑒定為Thymus mongolicus Ronn;HP－β－CD 批號(hào)100304，山東新大精細(xì)化工有限公司;無(wú)水硫酸鈉 沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠;無(wú)水乙醇

煙臺(tái)市雙雙化工有限公司;無(wú)水乙醚 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司;其他試劑 均為分析純。

JRA－6型數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司;LGJ－18S冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;AL系列溶劑過(guò)濾器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;揮發(fā)油提取器 華東醫(yī)藥器化有限公司;Focus GC－Polaris Q氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)熱電公司;Nicolet IS10型傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)熱電公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 揮發(fā)油的制備

1.2.1.1 包合前揮發(fā)油的制備 稱取經(jīng)陰干且粉碎粒度≤1.0cm的百里香植株地上部分100g，加10倍量蒸餾水，浸泡12h，按照2010年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄XD揮發(fā)油測(cè)定法提取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油并經(jīng)適量無(wú)水硫酸鈉脫水，離心分離，得黏稠狀淡黃色油狀液體，冷藏備用。

1.2.1.2 包合后揮發(fā)油的制備 取包合物適量，加水溶解后，用水蒸氣蒸餾法回提揮發(fā)油，收集揮發(fā)油并經(jīng)適量無(wú)水硫酸鈉脫水，離心分離，依下式計(jì)算揮發(fā)油空白回收率、利用率。

揮發(fā)油空白回收率(%)=收集的揮發(fā)油量(mL)/加入的揮發(fā)油量(mL)×100

揮發(fā)油利用率(%)=包含物中揮發(fā)油量(mL)/投油量(mL)×空白回收率×100

1.2.2 百里香揮發(fā)油HP－β－CD包合物的制備 稱取一定量的HP－β－CD于三角燒瓶中，加蒸餾水適量，置于數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋中攪拌使其溶解。另取一定量的百里香揮發(fā)油，用等量無(wú)水乙醇溶解后邊攪拌邊緩慢滴入恒溫的上述溶液中，繼續(xù)攪拌一定時(shí)間后停止加熱，使之?dāng)嚢璨⒗鋮s至室溫后，用0.45μm有機(jī)微孔濾膜抽濾，濾液在冰箱中預(yù)凍24h后，置冷凍干燥儀中冷凍干燥48h，得百里香揮發(fā)油的HP－β－CD包合物;包合物再用無(wú)水乙醚洗滌，除去表面殘留的百里香揮發(fā)油，然后揮去無(wú)水乙醚并依下式計(jì)算包合物得率。

包含物得率(%)=包含物收得量(g)/(β－CD投入量(g)+揮發(fā)油投入量(g))×100

1.2.3 百里香揮發(fā)油HP－β－CD包合物制備工藝的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為探索HP－β－CD包合百里香揮發(fā)油的最佳工藝條件，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，以影響HP－β－CD包合百里香揮發(fā)油的主要因素:揮發(fā)油(mL)與HP－β－CD(g)的體積質(zhì)量比(A)、包合溫度(B)、攪拌時(shí)間(C)及HP－β－CD的濃度(D)為考察因素，以包合物得率和揮發(fā)油利用率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)各指標(biāo)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響以及考慮到生產(chǎn)成本和包合效果，按權(quán)重系數(shù)分別為0.3和0.7進(jìn)行綜合評(píng)分(綜合評(píng)分=包合物得率×0.3+揮發(fā)油利用率×0.7)，選用L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化最佳工藝條件，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平見(jiàn)表1。

表1 百里香揮發(fā)油HP－β－CD包合工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal test on inclusion of volatile oil with HP－β－CD

1.2.4 包合前后百里香揮發(fā)油化學(xué)成分的GC－MS分析條件

1.2.4.1 氣相色譜條件 色譜柱:TR－5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30m ×0.25mm ×0.25μm);柱溫:250℃;進(jìn)樣口溫度:250℃;程序升溫:從50℃開(kāi)始，保持3min，以8℃/min的升溫速率升至250℃，并保持2min;載氣:高純氦氣;載氣流速:1.0mL/min;載氣模式:恒流模式;進(jìn)樣方式:分流進(jìn)樣;分流比1∶20。

1.2.4.2 質(zhì)譜條件 傳輸線溫度:270℃;電離方式:EI源;電子能量:70eV;離子源溫度:250℃;質(zhì)量掃描方式:全掃描;質(zhì)量掃描范圍:50～650amu;溶劑延遲:2min;質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù):NIST2005版標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜檢索庫(kù)。

在上述分析條件下，取用無(wú)水乙醚稀釋的包合前后的百里香揮發(fā)油各0.2μL進(jìn)樣分離，得總離子流圖，經(jīng)氣相色譜處理機(jī)用面積歸一化法從其總離子流圖中計(jì)算各組分的百分含量，通過(guò)揮發(fā)油的GC－MS總離子流色譜檢測(cè)，所得質(zhì)譜圖經(jīng)NIST05版計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并結(jié)合譜圖解析，確定并比較包合前后百里香揮發(fā)油的化學(xué)成分。

1.2.5 百里香揮發(fā)油HP－β－CD包合物的FT－IR分析 分別取HP－β－CD、包合前后的百里香揮發(fā)油、百里香揮發(fā)油與HP－β－CD的物理混合物及其包合物適量，用KBr壓片后于400～4000cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外吸收光譜掃描。

表2 HP－β－CD包合百里香揮發(fā)油工藝L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of orthogonal test on inclusion of volatile oil with HP－β－CD

2 結(jié)果與分析

2.1 百里香揮發(fā)油HP－β－CD包合物制備工藝的正交實(shí)驗(yàn)

百里香揮發(fā)油HP－β－CD包合物制備工藝的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 HP－β－CD包合百里香揮發(fā)油工藝L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table3 Variance analysis of orthogonal test on inclusion of volatile oil with HP－β－CD

由表2直觀分析可知，各因素對(duì)百里香揮發(fā)油包合效果影響的大小順序?yàn)?B＞A＞C＞D。由表3方差分析可知，A、B、C三個(gè)因素各水平間有顯著性差異，D因素3個(gè)水平間無(wú)顯著性差異。因此，正交實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)分法優(yōu)選出的百里香揮發(fā)油HP－β－CD包合物的最佳制備工藝條件為A3B1C2D1，即:百里香揮發(fā)油與 HP－β－CD 的體積質(zhì)量比為1∶10(mL∶g)，包合溫度30℃，攪拌時(shí)間2.5h，HP－β－CD的濃度5%。

2.2 百里香揮發(fā)油HP－β－CD包合物最佳制備工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)優(yōu)選出的最佳工藝條件A3B1C2D1進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，制備三批包合物，所得各評(píng)價(jià)指標(biāo)穩(wěn)定，百里香揮發(fā)油HP－β－CD包合物的平均得率為91.77%，平均揮發(fā)油利用率為81.94%，平均綜合評(píng)分為85.82(見(jiàn)表4)，說(shuō)明優(yōu)選出的包合工藝穩(wěn)定、可行。

2.3 包合前后百里香揮發(fā)油化學(xué)成分的GC－MS分析

圖1 HP－β－CD包合前后百里香揮發(fā)油GC/MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ionic current chromatogram of volatile oil by GC－MS before and after being included by HP－β－CD

通過(guò)GC－MS聯(lián)用技術(shù)分離分析，并用質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)檢索和面積歸一化法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)圖1和表5。百里香揮發(fā)油的主要化學(xué)成分為百里香酚、1－甲基－2－(1－異丙基)－苯、1－甲氧基－4－甲基－2－(1－異丙基)－苯、茨醇、石竹烯、石竹烯氧化物、1－甲基－4－(1－異丙基)－1，4－環(huán)己二烯等。由表5可知，HP－β－CD包合前后百里香揮發(fā)油的主要化學(xué)成分基本相同，但揮發(fā)油中各組分的組成比例發(fā)生了一定程度的改變，百里香酚、1－甲氧基－4－甲基－2－(1－異丙基)－苯所占比例有所降低，茨醇、1－甲基－4－(1－異丙基)－1，4－環(huán)己二烯所占比例有所增加，而1－甲基－2－(1－異丙基)－苯、順式－1－甲基－4－(1－異丙基)－2－環(huán)己烯－1－醇分別轉(zhuǎn)變?yōu)槠渫之悩?gòu)體1，2，4，5－四甲基苯、桉葉醇，其他成分的變化程度也不盡相同，說(shuō)明包合對(duì)百里香揮發(fā)油的化學(xué)成分的組成和比例略有影響［13－14］。

表4 百里香揮發(fā)油HP－β－CD包合最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Stability test on inclusion process of volatile oil with HP－β－CD

2.4 百里香揮發(fā)油 HP－β－CD包合物的 FT－IR分析

HP－β－CD、包合前后的百里香揮發(fā)油、百里香揮發(fā)油與HP－β－CD的物理混合物及其包合物的紅外吸收光譜如圖2所示。分析指紋區(qū)紅外吸收光譜圖，百里香揮發(fā)油在 1421、1252、1088、991、934、808cm－1處的吸收峰在包合物中均未出現(xiàn)，而HP－β－CD 在 1645、1459、1374、943、852cm－1處的吸收峰在物理混合物和包合物中同時(shí)出現(xiàn)，物理混合物的吸收峰在HP－β－CD和百里香揮發(fā)油的紅外圖譜中均可找到，說(shuō)明百里香揮發(fā)油已被HP－β－CD所包合。相對(duì)包合前的百里香揮發(fā)油，包合后的百里香揮發(fā)油在 1628、1514、1172、636cm－1處產(chǎn)生了新的吸收峰，說(shuō)明HP－β－CD包合對(duì)百里香揮發(fā)油的化學(xué)成分略有影響。

圖2 各物質(zhì)的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of all material

3 結(jié)論

正交實(shí)驗(yàn)與綜合評(píng)分相結(jié)合優(yōu)選的水溶液攪拌法制備百里香揮發(fā)油HP－β－CD包合物的最佳包合工藝條件為:百里香揮發(fā)油與HP－β－CD的體積質(zhì)量比為1∶10(mL∶g)，包合溫度 30℃，攪拌時(shí)間 2.5h，HP－β－CD的濃度5%，在此最佳工藝下，平均包合物得率、平均揮發(fā)油利用率、平均綜合評(píng)分分別為91.77%、81.94%、85.82，該工藝合理、穩(wěn)定、可行。

表5 HP－β－CD包合前后百里香揮發(fā)油主要化學(xué)成分的GC－MS對(duì)比分析Table5 Comparison analysis of main chemical components of volatile oil before and after being included by HP－β－CD through GC－MS

續(xù)表

GC－MS與FT－IR分析表明，百里香揮發(fā)油與HP－β－CD形成了包合物，包合前后百里香揮發(fā)油的主要化學(xué)成分基本相同，但揮發(fā)油中各組分的組成比例發(fā)生了一定程度的改變，包合對(duì)百里香揮發(fā)油的化學(xué)成分略有影響。

［1］陳麗艷，王昶.百里香精油的化學(xué)成分分析及其抗菌活性［J］.黑龍江醫(yī)藥，2009，22(5):636－637.

［2］Seung Joo Lee，Katumi Umano，Takayuki Shibamoto，et al.Identification ofvolatile components in basil(Ocimum basilicum L.)and thyme leaves(Thymus vulgaris L.)and their antioxidant properties［J］.Food Chemistry，2005，91(1):131－137.

［3］JunichiroYamamoto，KaoriYamada，AkiNaemura，et al.Testing various herbs for antithrombotic effect［J］.Nutrition，2005，21(5):580－587.

［4］孫震曉，馬清溫.百里香活性成分及藥理作用研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2009，7(2):175－178.

［5］張繼，田玉汝，劉忠旺，等 .百里香屬植物研究進(jìn)展［J］.北方園藝，2010(1):226－228.

［6］任茂生，王娣，田長(zhǎng)城.百里香屬植物的功能利用與成分研究進(jìn)展［J］.中國(guó)釀造，2010(12):8－11.

［7］閆子?jì)?，張有林，于月?百里香揮發(fā)油成分分析及急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(2):144－146.

［8］李運(yùn)，郭泉生，段博文，等.甘肅產(chǎn)百里香揮發(fā)油成分的GC/MS 分析［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(11):83－87.

［9］孔慧，倪健，邱海霞.地椒揮發(fā)油－β－環(huán)糊精包合方法的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2006，31(8):691－692.

［10］馬君義，張繼，王寶生，等.百里香油β－環(huán)糊精包合物的制備與表征［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(3):95－99.

［11］馬君義，張繼，魏相龍，等.百里香揮發(fā)油β－環(huán)糊精包合工藝研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，29(5):422－427.

［12］艾莉，董英杰，張乃先，等.莪術(shù)油－羥丙基－β－環(huán)糊精包合物的制備與表征［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，24(9):528－531.

［13］夏春秀，李宗.丁香油β－環(huán)糊精包合前后化學(xué)成分的GC－MS分析［J］.中藥新藥與臨床藥理，2006，17(3):214－215.

［14］李苑新，索緒斌，霍務(wù)貞，等.薄荷油β－環(huán)糊精包合前后成分與口感的變化研究［J］.中國(guó)藥房，2011，22(47):4450－4451.