沙田柚中不同部位黃酮類物質(zhì)的分布及含量探討

陽梅芳，曾新安，楊 星

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640;2.廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點實驗室，廣東廣州 510640;3.廣州現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)中心，廣東廣州 511458)

柚子是柑橘中的一大類，是人們喜愛的水果之一，有天然水果罐頭的美稱。然而多年來人們比較重視柚子果實的利用而忽略了對柚皮資源的開發(fā)，在柚子果實加工后，大約剩下50%皮渣，傳統(tǒng)的方法是將其進行填埋或加工成飼料，從環(huán)境和經(jīng)濟的角度分析都是不科學的解決途徑。柚子中含有大量的黃酮類物質(zhì)，近年來，從柚皮中提取黃酮類等生物活性物質(zhì)受到廣泛的關(guān)注［1－7］，不同柚子種類以及它們的提取物的抗氧化性均得到了證實［8－10］。柚皮黃酮類化合物主要為柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷等黃烷酮類，其中柚皮苷占80%以上［11］，但是不同柚子品種中黃酮類物質(zhì)含量和種類不相同。柚皮苷是一類天然黃酮類(Flavonoids)，主要存在于柚子、葡萄柚、酸橙及其變種的果皮中［12－13］。柚皮苷被廣泛應用于醫(yī)學、食品科學、化學等方面。黃酮類化合物是一類在植物界中分布廣泛、具有多種生物活性的多酚類化合物。黃酮類化合物也是植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的一大類化合物，是以黃酮2－苯基色原酮為母核的一類黃色色素，其中包括黃酮的同分異構(gòu)體異黃酮及其原產(chǎn)物黃烷酮。黃酮類化合物廣泛分布在植物界中，在植物的葉子和果實中少部分以游離形式存在，大部分與糖結(jié)合成苷類以糖配基的形式存在。近年來研究表明，黃酮類物質(zhì)具有維持血管正常滲透壓，降低血管脆性，降低人體膽固醇含量，抗過敏，降血壓，抑制癌變和抗病毒作用［14］。本實驗研究柚子的各個有效部位中黃酮類物質(zhì)的分布，采用HPLC－ELSD分析不同部位的黃酮類物質(zhì)的分布和含量種類差異。為以后的強化柚皮黃酮的提取提供了有效的數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

柚子 市售，沙田柚;蘆丁標準品(純度為99%)國藥集團化學試劑有限公司;柚皮苷標準品(純度為98%)、橙皮苷(純度為98%)、新橙皮苷(純度為98%) 南京澤朗醫(yī)藥;95%乙醇;亞硝酸鈉、甲醇(色譜純) 上海凌峰化學試劑有限公司;硝酸鋁、乙腈(色譜純) 天津市科密歐化學試劑有限公司;氫氧化鈉 南京化學試劑有限公司。

1260型高效液相色譜儀 安捷倫;Alltech 3300蒸發(fā)光檢測器 ELSD;TU－1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析科學儀器有限公司;KQ－100DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;DHG－9620A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;DQ－XP22柚子削皮機 廣州達橋食品設備公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 柚子不同部位中總黃酮類物質(zhì)的分布

1.2.1.1 標準曲線制備 標準液的配制:精密稱取120℃干燥恒重的蘆丁標準品10mg，置50mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容，得到濃度為0.2g/L的蘆丁標準溶液。

標準曲線的繪制:采用戴維斯法測定總黃酮(傳統(tǒng)方法)。精密量取標準溶液各 0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置于25mL容量瓶中，分別加60%乙醇溶液至10mL，再依次加入1mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6min后加入1mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6min后加入4%氫氧化鈉溶液1mL，再加60%乙醇定容，搖勻，放置15min后在500nm處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標，蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標，制作標準曲線，如圖1所示，得到標準曲線的回歸方程為:A=12.546C－0.0047，R2=0.9993。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The standard curve of rutin

1.2.1.2 總黃酮類物質(zhì)的測定 將柚子的油胞層、白囊衣、內(nèi)囊衣、果肉和果核打碎，準確稱取5g于三角瓶中，加入無水乙醇50mL，超聲輔助提取(45℃，100W，30min)，過濾，定容，取待測液適量，按照標準曲線的方法在500nm下測定其吸光值，計算含量。實驗進行三次，取平均值。

1.2.2 柚子不同部位黃酮類物質(zhì)的種類

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱(waters symmetry C18，4.6mm ×150mm，5μm);流動相∶乙腈－水 =(23∶77，v/v);流速 1.0mL/min;柱溫 25℃;進樣量 20μL。ELSD條件:漂移管溫度52℃;氣體流速1.6mL/min;增益值1。

1.2.2.2 實驗流程 將柚子果實中的各個有效部位按照流程圖2進行，研究不同部位的黃酮類物質(zhì)。流程圖2中的水洗條件為用1000mL蒸餾水浸洗一次;干燥條件為在45℃烘箱中干燥;提取條件為準確稱取干燥樣品2g，各加入20mL甲醇，密封，稱量，超聲波輔助提取(功率100W，溫度45℃，時間30min)。得到樣品A～J。

圖2 柚子黃酮類物質(zhì)種類研究的流程圖Fig.2 The process of the study of kinds of flavonoids in Shatian grapefruite

1.2.2.3 標準品溶液 分別精密稱取柚皮苷0.0109g，橙皮苷0.0038g，新橙皮苷0.0103g混合于燒杯中，用甲醇溶解，定容至10mL，配制成濃度分別為1.09、0.38、1.03g/L的貯備液，將儲備液用甲醇稀釋至不同的濃度，制成一系列梯度混合對照品溶液。1.2.2.4 供試品溶液 將上述流程圖中A～J樣品均取樣過0.45μm有機膜，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚子不同部位總黃酮類物質(zhì)的分布

由圖3可知，內(nèi)囊衣中黃酮含量最高，濃度為4.657mg/g;果核中黃酮類物質(zhì)含量最低，濃度為0.333mg/g。果皮、果肉和果核三者之中，果皮中含量最高，與文獻相符［15］。白囊衣和內(nèi)囊衣中含有大量的纖維素，黃酮類物質(zhì)容易和糖類物質(zhì)結(jié)合形成黃酮苷類物質(zhì)，這可能導致纖維素對黃酮類物質(zhì)有一定的富集作用。

2.2 HPLC－ELSD分析柚子不同部位黃酮類物質(zhì)含量和種類差異

2.2.1 三種物質(zhì)的線性范圍和線性方程 建立用HPLC－ELSD檢測柚皮中主要三種黃酮類物質(zhì)的方法，由表1可知，在一定濃度范圍內(nèi)，柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，該方法可以用來檢測樣品中的黃酮類物質(zhì)。X為峰面積的對數(shù)，Y為濃度的對數(shù)。由圖4可知，在上述液相條件下有很好的分離度。

圖3 柚子各部位總黃酮類物質(zhì)的分布Fig.3 The distribution of flavonoids in different parts in Shatian grapefruit

表1 3種主要黃酮類物質(zhì)的線性關(guān)系和線性范圍Table1 Linear regress equation and linear range

圖4 混合標準品的液相色譜圖Fig.4 Graph of the HPLC－ELSD of mixed standard substance

2.2.2 柚子不同部位柚皮苷含量分布 吳倩等［15］研究表明柚子中主要是柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷三種黃酮類物質(zhì)，由色譜分析可得出柚子中大部分黃酮類物質(zhì)為柚皮苷，柚皮苷的色譜圖像如圖5所示，不同部位待測樣品的柚皮苷含量結(jié)果如圖6所示。在待測樣品中，柚皮苷濃度最高的是內(nèi)囊衣I，柚皮苷含量為0.99mg/mL，柚皮苷總量為19.8mg。油胞層壓榨汁A的體積為20mL，濃度為0.287mg/mL，總量為5.74mg;樣品白囊衣水洗液E的柚皮苷含量是0.452mg/mL，體積為1000mL，柚皮苷總量為452mg，樣品果汁G的柚皮苷含量是0.22mg/mL，體積為90mL，柚皮苷總量為19.8mg。樣品 D、F、H、J的體積均為 20mL，總量依次為 18.16、19.76、4.2、2.6mg。

由于在一個柚子果實中每個有效部位的質(zhì)量不一樣，所以需要按照質(zhì)量比折算成整個果實柚皮苷的含量。一個新鮮柚子果實(1kg)中，油胞層0.1kg(10%)、白囊衣 0.2kg(20%)、內(nèi)囊衣 0.1kg(10%)、果核0.05kg(5%)、果肉0.5kg(50%)。干燥后，油胞層20g、白囊衣50g、內(nèi)囊衣20g果核/10g。油胞層中柚皮苷含量為5.74mg;白囊衣柚皮苷含量大約為490mg;內(nèi)囊衣柚皮苷總量為198mg，果肉中柚皮苷總量為24mg，果核中柚皮苷含量為13mg。柚皮苷濃度最高的部位是內(nèi)囊衣，柚皮苷總量最高的是白囊衣。由圖6可知，油胞層中的油層中柚皮苷未被檢測到，說明油胞層中的柚皮苷是存在于水相的。白囊衣樣品D、E、F的柚皮苷總量可知，白囊衣中的柚皮苷存在于纖維結(jié)構(gòu)里面和纖維結(jié)構(gòu)之間，可以水洗下來。果核和果汁中的柚皮苷總量較低。

2.2.3 柚子不同部位黃酮類物質(zhì)的種類 由HPLCELSD結(jié)果分析可知，柚子油胞層比其他有效部位的黃酮種類要多一種，根據(jù)文獻可知柚子黃酮類物質(zhì)主要有柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷。但是，在本實驗中，柚皮的各個有效部分在實驗檢測條件下均沒有檢測到橙皮苷和新橙皮苷，可能是由于含量過少，在樣品提取處理中沒有提取出來。樣品中大部分的黃酮類物質(zhì)為柚皮苷，與文獻相符。油胞層中的柚皮苷絕大部分存在于壓榨汁中，油胞層中的黃酮類物質(zhì)是以果皮的水相中，白囊衣的三種處理方式(直接干燥、水洗后干燥和直接水洗)得到的黃酮類物質(zhì)種類一致，白囊衣水洗液中含有柚皮苷，白囊衣中柚皮苷可以用水清洗下來，這個說明柚皮苷是和白囊衣中的組織結(jié)構(gòu)以物理形式結(jié)合起來的。

圖5 柚皮苷的HPLC－ELSD圖譜Fig.5 Graph of the HPLC－ELSD of naringin

圖6 柚子中各個部位的柚皮苷濃度Fig.6 The concentration of narigin in virous parts

3 結(jié)論

柚中黃酮類物質(zhì)主要有柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷三種，通過柚皮苷濃度比較，大部分黃酮類物質(zhì)為柚皮苷，而橙皮苷和新橙皮苷含量很微少。其中，內(nèi)囊衣中濃度最高，其次為白囊衣，柚皮苷總量為白囊衣最多，可能是由于白囊衣中富含果膠等多糖類物質(zhì)，黃酮類物質(zhì)大多以與糖結(jié)合的苷類形式存在。白囊衣的水洗液和直接干燥物中的黃酮成分一樣，只是含量不同，而且大部分黃酮類物質(zhì)可以水洗浸出，黃酮類物質(zhì)可能存在于白囊衣的纖維組織之間，并且以物理的結(jié)合方式存在于果實中。柚子黃酮類物質(zhì)的存在與組織結(jié)構(gòu)的關(guān)系有待進一步研究。

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