不同地域萊氏野村菌的培養(yǎng)性狀及對斜紋夜蛾的毒力

唐維媛，彭小東，王歡，周換景，張義明

(1.貴州大學化學與化工學院，貴州 貴陽 550003；2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550003；3.貴州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院化學與材料系，貴州 貴陽 550008；4.貴州省昆蟲研究所，貴州 貴陽 550025)

斜紋夜蛾(Spodoptera litura (Fabricius)) 已知寄主植物有大豆、棉花、煙草等290 多種，主要危害植物的葉片和幼嫩莖稈[1–4]，其發(fā)生呈間歇性爆發(fā)形式，危害極大。目前，防治斜紋夜蛾主要仍以化學防治為主，但斜紋夜蛾對化學農(nóng)藥抗藥性逐漸增強，防治效果也隨之下降，且嚴重破壞生態(tài)平衡。

萊氏野村菌(Nomuraea rileyi (Farlow) Samson))寄主范圍大，能寄生40 余種昆蟲，尤其對鱗翅目夜蛾科類的昆蟲有著很強的致病力，且對益蟲、捕食者和人體無害，與化學殺蟲劑也有較好的兼容性[5–7]。萊氏野村菌這些特性決定了它在農(nóng)林害蟲的防治，尤其是在有害生物綜合治理(IPM)防治策略方面有著很大的開發(fā)和應用潛力[8]。筆者對來自山東、安徽、河南的3 株萊氏野村菌的生物學特性進行研究，主要考察不同地區(qū)的萊氏野村菌菌株的致病力、菌落生長狀況及產(chǎn)孢量的異同，以期為該菌的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

斜紋夜蛾3 齡幼蟲，由河南省濟源白云實業(yè)有限公司提供。萊氏野村菌菌種Nr12(山東)、Nr19(安徽)和Nr42(河南)，由安徽農(nóng)業(yè)大學蟲生真菌菌種保藏庫提供。將真菌接種在PDA 培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)(25±1) ℃恒溫培養(yǎng)10 d，待用。

1.2 方 法

1.2.1 菌液制備

將3 株真菌的分生孢子粉刮到盛有20 mL 0.05%吐溫–80 無菌水的三角瓶(含玻璃珠)中，在渦旋振蕩器上充分振蕩，血球計數(shù)板計數(shù)，用0.05%吐溫–80 溶液稀釋，配制成1.0×107個/mL 的孢子菌懸液。

1.2.2 菌落及孢子產(chǎn)量的測量

依據(jù)文獻[9]方法。用微量移液槍吸取10 μL 菌懸液滴在配制好的PDA 固體平板表面，品字型接種，每點呈一圓形接種面，靜置15 min 后，移至(25±1) ℃的光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長出菌絲后，每天測量菌落直徑，連續(xù)測量7 d，計算菌絲的生長速率。10 d 后用直徑6.35 mm 的打孔器從菌落中心至邊緣的中點取菌塊3 個，置于試管中，3個重復，用吐溫–80 無菌水洗脫孢子，在渦旋振蕩器上充分振蕩10 min，血球計數(shù)板測定孢子含量，折算成每cm2的孢子含量。

1.2.3 試蟲接菌與飼養(yǎng)

采用浸蘸法對試蟲進行接菌[10–11]。將3 齡幼蟲放入萊氏野村菌孢子懸液中浸蘸5～10 s 后，晾干蟲體表面的水分后，分裝至培養(yǎng)皿中，喂以飼料，皿內(nèi)用濕棉球保濕，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) (14 h 光照，10 h 黑暗)，每個處理試蟲15 頭，3 個重復，以0.05%吐溫–80 無菌水處理作為對照。對幼蟲接種菌液后，每日早、晚按時觀察和記錄其行為、感病癥狀、死亡蟲數(shù)，連續(xù)觀察10 d。中途及時清除養(yǎng)蟲器皿中的排泄物，更換飼料。每天將檢查出的死蟲單獨放入小盒中，25 ℃下保濕培養(yǎng)，觀察記錄其變化情況，根據(jù)蟲尸上長出的菌絲癥狀，統(tǒng)計僵蟲率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以LT50、校正死亡率和僵蟲率作為試蟲毒力分析的指標。以時間(d)的對數(shù)為自變量(x)，死亡率的機率值為因變量(y)，采用機率值分析法[12],計算毒力回歸方程和LT50值，據(jù)此分析不同菌株的毒力。

2 結(jié)果與分析

2.1 萊氏野村菌菌株的生長性狀及產(chǎn)孢情況

在25 ℃下光照培養(yǎng)10 d 后，3 株菌株的菌落絨毛狀，干燥，厚度中等，較為致密；基質(zhì)呈淺褐色，孢子粉呈綠色，菌落形態(tài)差異不明顯，但基質(zhì)顏色及孢子粉色澤差異較為明顯，Nr19 基質(zhì)及孢子粉色澤比Nr42 的深。

3株菌株在PDA培養(yǎng)基上表現(xiàn)出不同的生長性狀(表1)。均在第4 天開始產(chǎn)生白色菌絲，其中以Nr12 的菌落生長速率最快，為1.14 mm/d，但三者差異不明顯；以Nr19 產(chǎn)孢量最高，達到1.64×108個/cm2，且與另2 株的產(chǎn)孢量差異極顯著(P<0.01)，表明Nr19 的培養(yǎng)性狀優(yōu)于Nr12 和Nr42。

表1 供試菌株在PDA 培養(yǎng)基上的生長及產(chǎn)孢情況Table 1 Growth and sporulation of different strains on PDA

2.2 萊氏野村菌對斜紋夜蛾幼蟲的感病癥狀

3 株菌株對斜紋夜蛾幼蟲均有致死作用，幼蟲的感病癥狀相似。感病初期，試蟲進食量減少或不進食，活動力減弱，有些被侵染的試蟲體表色澤發(fā)暗。幼蟲被寄生死亡后，手觸之，其身體柔軟，1 d后，身體僵直、硬化。高濕條件下培養(yǎng)1 d 后，蟲體的背部及腹部先出現(xiàn)白色菌絲，逐漸整個蟲體表面被白色菌絲完全覆蓋，繼續(xù)保濕培養(yǎng)1~2 d，白色轉(zhuǎn)變?yōu)椴菥G色，繼而轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹G色，蟲尸體表被綠色分生孢子覆蓋全身。分生孢子干燥疏松，易松散，自然條件下可在蟲尸周圍彈射。繼續(xù)培養(yǎng)，蟲尸被分生孢子侵蝕，體內(nèi)水分散失，蟲體逐漸癟塌，孢子堆積在蟲尸體表和蟲尸周圍。

2.3 萊氏野村菌對斜紋夜蛾3 齡幼蟲的毒力

3 株菌株對斜紋夜蛾3 齡幼蟲均表現(xiàn)出不同程度的致病性，但致死效果差異明顯(表2)，其中Nr12的校正死亡率最高，為100%，其次是Nr19，為97.62%。 3 株萊氏野村菌菌株對斜紋夜蛾3 齡幼蟲的校正死亡率都在95%以上，說明萊氏野村菌是對斜紋夜蛾3 齡幼蟲具有強毒力。

3 株菌株的僵蟲率都達到80%以上，且致死速率也較快，Nr19 的LT50為4.044 1 d，僵蟲率達84.09%，顯著高于另2 株菌株，表明3 株菌株都能侵染致死斜紋夜蛾3 齡幼蟲，且其孢子粉松散，易于在害蟲種群間散布，形成二次侵染。其致死率和僵蟲率較高的原因可能是斜紋夜蛾3 齡幼蟲的齡期較低，對萊氏野村菌的敏感性高，且3 齡的蟲體較大，營養(yǎng)豐富，菌體侵入后，利于其生長和繁殖。

表2 萊氏野村菌菌株對斜紋夜蛾3 齡幼蟲的致病效果Table 2 Pathogenic effects to the 3rd instar larva of S. Litura treated with different strains

3 結(jié) 論

萊氏野村菌曾一度成為美國和巴西等國控制黎豆夜蛾在經(jīng)濟危害閾值以下的關(guān)鍵因子[13–15]。本研究選取的來自3 個省份的3 株菌，雖然菌落形態(tài)和生長速率差異并不明顯，但是其孢子粉色澤及產(chǎn)孢量存在明顯差異，這說明不同地區(qū)菌系存在生理差異。供試菌株對斜紋夜蛾幼蟲校正死亡率均達到95%以上，說明在不同地區(qū)都適用于防治該類害蟲。

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