辣椒CHS 基因表達的定量分析及與雄性不育的相關(guān)性

陳遙，彭彥，劉峰，張學(xué)文*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，湖南 長沙 410125)

辣椒是中國的一種重要的蔬菜。利用辣椒雄性不育進行制種是提高辣椒制種效率和降低成本的有效途徑。胞質(zhì)雄性不育(CMS)是細胞質(zhì)內(nèi)的遺傳物質(zhì)決定的不育現(xiàn)象，是高等植物不能形成有功能花粉的遺傳方式。由于CMS 并不影響植株的整體發(fā)育，且這種不育性能被逆轉(zhuǎn)[1–2]，因此被廣泛應(yīng)用到雜交育種中。在植物雄性不育配套系統(tǒng)中，不育系與保持系具有一致的核遺傳背景，因此，兩者細胞質(zhì)遺傳成分的差異便能解釋CMS 的原因。運用這一原理，目前已鑒定出線粒體中的coxII、atp6、orf456、orf507[3–5]等與辣椒不育系不育性狀相關(guān)的基因，但是這些基因如何與核基因相互作用、如何躲避不育恢復(fù)基因[6]的控制、如何使得雄配子失活等具體分子機制還不清楚。

根據(jù)不育系與保持系的基因差異可以找出許多植物不育性狀的基因，但還有很多植物的不育性狀的相關(guān)基因未能根據(jù)不育系與保持系基因的差異被找到，可能不育性狀還與基因表達的差異或表達調(diào)控的差異相關(guān)。為了深入闡述辣椒CMS 的分子機制，筆者分別從辣椒不育系9704A 與其同核保持系9704B 的花蕾中分離總RNA，采用Solexa 法完成了轉(zhuǎn)錄組測序。經(jīng)過序列分析，從不育系和保持系中查找表達差異較大的基因，其中1 種類似于查爾酮合酶(CHS)的基因在9704B 中的表達量是9704A 中的16 倍。根據(jù)其序列設(shè)計特異引物，采用RT–PCR 方法從辣椒中克隆了該基因的cDNA，同時利用特異引物進行實時熒光定量RT–PCR 對2種辣椒材料不同組織中該基因的表達進行了定量分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

1) 供試作物。供試辣椒品種為湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所選育的辣椒(Capsicum annuum L.)不育系9704A 和同核保持系9704B。將種子置于黑土、沙子、蛭石體積比為1∶1∶1 的營養(yǎng)缽中，于室內(nèi)培養(yǎng)，白天24 °C，夜晚18 °C，周期變溫，每天光照時間為16 h。在植株開花期，取根、莖、葉以及成熟即將開放的花蕾，清潔后置液氮中，用于RNA 提取。

2) 菌株。大腸桿菌E.coli DH5α，為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細胞生物學(xué)實驗室提供。

3) 主要試劑。RNA 提取試劑 Trizol 購于Invitrogen 公司；cDNA 第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Fermentas 公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于維爾生物公司，pMD18–T 載體購自全式金有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 辣椒RNA 的提取

用Trizol 試劑，按照說明提取辣椒花蕾的RNA及根、莖、葉的RNA。用DEPC 處理過的水溶解干燥的RNA，并用光譜檢測總RNA 的完整性。從總RNA 樣品中取8 μL，采用2010 生物分析儀檢測RNA 的完整性。

用Trizol 法提取辣椒根、莖、葉的總RNA，分別取12 μL 用Oligo(dT)為引物按照說明書進行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 Solexa 測序及拼接

利用Dynabeads Oligo (dT)將辣椒花蕾mRNA從總RNA 中分離出來，在高溫下用二價陽離子將mRNA 打碎成小片段。 這些小片段RNA 用逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機性引物各自單獨反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，第二鏈合成用DNA 聚合酶I 和RNaseH。最后，這些小cDNA 片段用Illumina 基因組分析儀進行Solexa 測序。

測序得到的序列通過GenBank 和UniProt 數(shù)據(jù)庫比對，去掉了e 值為10–5的序列，得到辣椒的非重復(fù)序列。這些非重復(fù)序列用EST Scan[7]翻譯成蛋白質(zhì)，將翻譯出的蛋白質(zhì)在數(shù)據(jù)庫 InterPro 和 Pfam domain 進行比對。

非重復(fù)序列在花蕾中的表達量根據(jù)RPKM 算法[8]進行計算。

1.2.3 基因表達差異分析

用Stekel 等[9]發(fā)明的R 統(tǒng)計值分析9704A 和9704B 中表達差異顯著的基因。

1.3 表達差異顯著基因的克隆

根據(jù)表達差異顯著基因的序列，設(shè)計擴增核心區(qū)域和全長基因的引物。擴增核心區(qū)域的引物為A–s up(5'–ATGTCAGAGAACAACAAGAATG–3' )；A–s down(5'–TTAGAGACTCCTAAGGAGTATGC–3' )。擴增全長序列的引物為A–s outup(5'–CAACACAAT TATACCAACTTTTC–3')，A–s outdown(5'–TGGGAT GGTAATTTTAAGAAA–3')。PCR 反應(yīng)總體系為25 μL，其中cDNA 模板1 μL，10 μmol/L 上下游引物(A–s up/ A–s down 或A–s outup/ A–s outdown)各1 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，5 U/μL Taq 酶0.25 μL，10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 18.75 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 °C 預(yù)變性5 min；30 個熱循環(huán)的參數(shù)為94 °C 變性l min，54 °C 退火1 min(全長基因50 °C退火)，72 °C 延伸72 s(全長基因延伸101 s)；最后72 °C 延伸10 min。PCR 產(chǎn)物放4 °C 保存。

擴增的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用試劑盒回收，將回收的片段TA 克隆到pUC18–T，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，用藍白斑篩選，選取白色克隆菌進行PCR 檢測后，搖菌提質(zhì)粒做酶切檢測，最后將陽性質(zhì)粒送博尚測序公司進行測序。

1.4 辣椒表達差異顯著基因的RT–PCR 檢測

以辣椒不同組織的cDNA 為模板，以辣椒actin基因作為內(nèi)標基因同時進行熒光定量PCR 反應(yīng)。用于辣椒CHS 基因擴增的引物為Up(5'–GGACGCGT AATGCTCTACTT–3' )和Dn(5'–AGAACTCTGCTT CCTGGATTG–3' )。用于辣椒actin 擴增的引物為actin–up(5'–GAAGCACCTCTCAACCCTAAG–3' )，actin–down(5'–GACCACTAGCATACAAGGAAAG A–3' )。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列拼接分析

高通量測序共測出9.6×107個序列。這些序列被拼接成了60 497 個非重復(fù)序列，平均長度為520 bp。經(jīng)過同源性比對，有35 733 個非重復(fù)序列翻譯出的蛋白質(zhì)功能研究比較清楚。

進一步計算分析表明，有1 203 個基因在不育系和保持系的花蕾中表達差異顯著，其中521 個基因在不育系中表達較高，另外682 個基因在保持系中表達較高，這說明辣椒CMS 可能具有更復(fù)雜的機制。

通過計算，一種基因在9704A的花蕾的RPKM(A)值為12.78，然而在9704B 的花蕾的RPKM(B)值為205.58，其e 值為0，并且log2(RPKM(A)/PRKM(B))為－4.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)表明，在花蕾中，這種基因在保持系的表達量是不育系表達量的16倍。即這一基因在不育系中的表達顯著低于保持系。

將此基因序列在Genbank 上進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)這個基因為CHS 基因家族的花藥特異性表達基因。

2.2 CHS 基因的克隆結(jié)果

RT–PCR 擴增得到全長為1 675 bp 的cDNA 序列。該序列包含1 個1 191 bp 的開放閱讀框(ORF)、1 個148 bp 的5'UTR 和1 個336 bp 的3'UTR。BLAST顯示，克隆得到的 cDNA(GenBank 登錄號為KC771254)的核心序列與菸草(Nicotiana sylvestris) CHSLK 基因(GenBank 登錄號為 Y14506 及Y14507)、番茄 CHS 基因(GenBank 登錄號為AC239649)的同源性分別達90%和88%。

2.2 蛋白質(zhì)預(yù)測結(jié)果

用NCBI 上的ORF finder(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html)對辣椒花藥特異表達基因CHS 進行了分析，預(yù)測的蛋白質(zhì)序列見圖1。

CHS 基因編碼1 個由396 個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其相對分子質(zhì)量為43 800，等電點為5.65。采用SignalP 4.1 軟件分析得出該蛋白沒有信號肽，說明該蛋白滯留在合成的細胞內(nèi)。對該蛋白在細胞內(nèi)的定位分析顯示，葉綠體靶向肽值(cTP)為0.346，線粒體靶向肽值(mTP)為0.171，說明該CHS 蛋白更多的定位在葉綠體中。而CHS 也是一種色素合成酶，說明辣椒花藥特異性表達蛋白CHS 可能還參與辣椒的色素合成。

利用DNAman 對辣椒CHS 的氨基酸序列進行了疏水性分析，發(fā)現(xiàn)在整個多肽中親水性氨基酸占的比例較疏水性氨基酸高，說明該蛋白質(zhì)為親水性蛋白。而在CHS 蛋白家族中，CHS 蛋白屬于親水性蛋白。

對辣椒CHS 基因編碼的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的分析表明，該蛋白屬于CHS 蛋白家族，其N 端和C 端都與CHS 蛋白家族有極高的同源性，蛋白的活性位點和結(jié)合位點靠近C 端。

圖1 辣椒CHS DNA 序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 DNA sequence of chili pepper CHS and its deduced amino acid sequence

系統(tǒng)進化關(guān)系(圖2)顯示，辣椒花藥特異性蛋白CHS 與來源于雙子葉植物的CHS 蛋白家族成員親緣關(guān)系更近，其中與菸草(Nicotiana sylvestris)的親緣關(guān)系最近。NCBI 比對結(jié)果顯示，該蛋白與其他植物的CHS 蛋白差異也不大，同源性在74% ～ 92%，進一步說明該蛋白質(zhì)屬于CHS 蛋白家族，同時說明CHS 蛋白家族在進化上是比較保守的。

圖2 植物CHS 蛋白質(zhì)氨基酸序列的進化分析結(jié)果Fig.2 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of plant CHS proteins

2.3 辣椒CHS 基因在不同組織中的表達

從辣椒不育系9704A和保持系9704B不同組織中提取總RNA，進行RT–PCR。結(jié)果表明，在辣椒的根、莖、葉中都能檢測到CHS 基因片段，表明該基因在2 種辣椒的不同組織中都能表達。

從不育系和保持系辣椒的不同組織中提取細胞總RNA，熒光定量RT–PCR 分析表明，2 種辣椒的莖中CHS 幾乎不表達，而在保持系的根和葉中，CHS 基因的表達水平也很低，結(jié)合基因表達差異分析，得出正常情況下該基因在花藥中特異性高表達，但在不育系的根和葉中的表達卻異常升高，不育系根中CHS 的表達是保持系的4.5 倍；不育系葉中CHS 的表達是保持系的9 倍(圖3)。

結(jié)合Solexa 測序分析結(jié)果可知，CHS 基因具有一定的表達非特異性，除在花藥中具有高表達外，在葉和根中也有低水平表達，而莖中則幾乎不表達。但CHS 在不育系根、葉中的表達量則顯著高于其在保持系相應(yīng)組織中的表達，但在花中的表達量卻顯著低于保持系；因此CHS 基因在不育系中的表達是異常的，進而推測CHS 基因在不育系中的異常表達與辣椒雄性不育性狀相關(guān)。

圖3 CHS 基因在2 種辣椒根、莖和葉中表達的熒光定量RT–PCR 分析Fig.3 The RTFQ RT–PCR analysis of the expression of CHS in the root,stem and leaf of 9704A and 9704B

3 討 論

本試驗獲得的辣椒CHS 基因與查爾酮合酶基因家族(CHS gene family)的成員有很高的同源性，尤其與菸草花藥特異表達基因CHSLK 同源性最高，但其表達并不只特異性地局限于花藥，在辣椒的根、葉中都具有一定的表達量，但在莖中的表達量極低，幾乎不能檢出。有意義的是該基因的表達在不育系和保持系間具有表達模式和水平的差異，保持系花中的表達量是不育系的16 倍，而不育系根和葉中的表達量分別是保持系的4.5 和9 倍，表明該基因與辣椒的CMS 有關(guān)。

查爾酮合酶是形成黃酮類物質(zhì)起始第一步的催化酶[10]。玉米和矮牽牛查爾酮合酶基因突變體都是自交不可育的，添加小劑量的山柰酚黃酮醇在培養(yǎng)基上或涂抹柱頭都能使得植株恢復(fù)育性[11–13]，說明黃酮醇的生物合成及代謝對花粉的發(fā)育起了重要作用。黃酮醇是在花藥絨氈層細胞合成的[14]，CHS 突變體中黃酮醇前體物質(zhì)累積減少，黃酮類物質(zhì)在花粉發(fā)育過程中補給不足，導(dǎo)致花粉敗育[15]。目前，在小麥[16]、矮牽牛[15,17–18]、煙草[19–21]、水稻[22]中都相繼鑒定出了類查爾酮合酶基因，這類基因都能影響花藥黃酮類物質(zhì)的合成，并特異性地在花藥中表達。

本試驗分離得到的辣椒CHS基因是CHS家族中的一個基因，根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)和表達進化特征，推測該基因在辣椒花藥發(fā)育過程中起重要作用，但其生理功能和引起不育的具體機制還有待進一步驗證。

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