AtCS82 基因T–DNA 插入突變體篩選和 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的獲得

陳錦華，郭磊，易力雄，劉春林，阮穎*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院；b.農(nóng)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

目前，油菜已成為第三大經(jīng)濟(jì)作物[1]，而菜籽油已經(jīng)成為第二大植物油[2]。油菜菜籽油產(chǎn)量及其品質(zhì)的提高一直是油菜育種工作者重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題，而探尋脂肪酸代謝調(diào)控機(jī)理是油菜分子育種研究的一項(xiàng)重要內(nèi)容。目前，關(guān)于植物脂肪酸合成的部位與主要生化過(guò)程的研究成果[3–5]較多，而對(duì)其分子調(diào)控機(jī)理的報(bào)道較少。甘藍(lán)型油菜為異源四倍體，且生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，研究難度較高。相比之下，同屬十字花科的擬南芥具有植株小、生長(zhǎng)周期短、易于轉(zhuǎn)化、基因組小且遺傳信息豐富[6]等優(yōu)點(diǎn)，加之二者在基因組結(jié)構(gòu)上有一定的保守性[7–12]，擬南芥中的許多功能基因與油菜中的同源基因具有相似的功能[13]，這使得人們可以利用擬南芥的生物信息和DNA 資源，通過(guò)對(duì)擬南芥中同源基因的研究來(lái)加快對(duì)油菜基因組的研究。

本課題組在系統(tǒng)分析油菜種子發(fā)育和代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化過(guò)程的基礎(chǔ)上，以開花后20 d 和35 d 的油菜種子作為抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)的材料，構(gòu)建了油菜種子發(fā)育中同化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化2 個(gè)關(guān)鍵時(shí)期的SSH 文庫(kù)[14]。以該SSH 文庫(kù)為基礎(chǔ)，分析EST 序列[15]，并與擬南芥基因比對(duì)，篩選得到一個(gè)同源性較高、預(yù)期與油脂合成代謝相關(guān)的擬南芥基因序列，命名為AtCS82。

為了從分子水平研究AtCS82 基因的功能，首先需要獲得AtCS82 基因沉默的純合突變體和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。筆者通過(guò)對(duì)T–DNA 插入突變體的篩選，獲得了1 株穩(wěn)定遺傳的AtCS82 基因沉默純合突變體株系；通過(guò)構(gòu)建pCAMBIA1300–35S::CS82過(guò)表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞野生型(Col)，獲得了AtCS82 基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態(tài)型(Col)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控實(shí)驗(yàn)室保存；AtCS82 基因T–DNA 插入突變體cs82種子購(gòu)自美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心。將擬南芥種子播種于盛有浸透營(yíng)養(yǎng)液的蛭石的小缽中，避光4 ℃春化3 d，轉(zhuǎn)至22 ℃、16 h(光)/8 h(暗)光周期下培養(yǎng)，每周澆灌1～2 次營(yíng)養(yǎng)液。以生長(zhǎng)45 d 的Col 野生型植株為試驗(yàn)材料，進(jìn)行AtCS82基因表達(dá)水平分析；以生長(zhǎng)25 d 的突變體植株為試驗(yàn)材料，進(jìn)行純合子篩選。

1.2 AtCS82 基因T–DNA 插入純合突變體的篩選

1.2.1 擬南芥不同組織中AtCS82 的表達(dá)水平檢測(cè)

為了探尋AtCS82 基因在擬南芥不同組織中的表達(dá)水平，根據(jù)TAIR 網(wǎng)站(http://www.arabidopsis. org)上公布的擬南芥AtCS82 基因cDNA 序列，采用Primer Premier 5 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)了1 對(duì)引物CS82–S/CS82–A。引物序列為：CS82–S，5'–ATGAAT GCTATTAAGTTTGTTGTAC–3'；CS82–A，5'–TCAC GG TT TAGGC CCG–3'。

分別取生長(zhǎng)45 d 的Col 野生型擬南芥的莖、葉、花及生長(zhǎng)4、7 d 的果莢，采用Trizol 法[16]提取各組織的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以CS82–S/CS82–A為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為432 bp。

1.2.2 T–DNA 插入純合子的三引物檢測(cè)

使用三引物法[15]篩選T–DNA 插入純合突變體(以下簡(jiǎn)稱純合突變體)基因型的鑒定需要3 條引物(LP、RP 和BP)，使用T–DNA Primer Desig 網(wǎng)站(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)提供的在線工具設(shè)計(jì)所需的3 條引物，序列分別為：CS82– F(LP)，5'–GGCCTAGACCGAAAGCAATAC–3'；CS82–R(RP)，5'– CAACAACCGTTGTTTTTCCTG– 3'；LBb1.3(BP)，5'–TAGCATCTGAATTTCATAACC AATCTCGATACAC –3'。

將購(gòu)買的突變體cs82 種子播種于盛有蛭石的小缽內(nèi)，待植株生長(zhǎng)25 d 后，隨機(jī)選取10 株(編號(hào)為cs82–1～cs82–10)生長(zhǎng)良好者，以Col 野生型擬南芥為對(duì)照，分別提取全基因組DNA，分別采用LP/RP 和BP/RP 引物組合，以全基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，根據(jù)電泳結(jié)果判斷該植株是否為純合突變體。LP/RP 和BP/RP 預(yù)期PCR 產(chǎn)物大小分別為1 220 bp 和559～859 bp。

1.2.3 純合突變體中AtCS82 表達(dá)的RT–PCR 驗(yàn)證

根據(jù)表達(dá)部位分析試驗(yàn)的結(jié)果，選取適當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)期的已初步鑒定的純合突變體和Col 野生型擬南芥的適當(dāng)組織作材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以CS82–S/CS82–A 為引物，進(jìn)行RT–PCR檢測(cè)。

1.3 AtCS82 基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

1.3.1 引物設(shè)計(jì)及AtCS82 全長(zhǎng)CDS 片段的克隆

根據(jù)TAIR 網(wǎng)站上公布的擬南芥AtCS82 基因序列，采用Primer Premier 5 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物82CDS–F/82CDS–R，用來(lái)擴(kuò)增AtCS82 基因的全長(zhǎng)CDS，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為432 bp。根據(jù)載體pCAMBIA1300–35S 帶有的限制性酶切位點(diǎn)，在正反引物的5'端分別加上XbaI 和SacI 位點(diǎn)，序列為'(下劃線部分為XbaI 位點(diǎn))；3'(下劃線部分為SacI 位點(diǎn))。根據(jù)合成引物的預(yù)測(cè)退火溫度設(shè)計(jì) PCR 的溫度梯度，確定了引物82CDS–F/82CDS–R 的最適退火溫度為59 ℃。

以Col 野生型擬南芥為材料，采用Trizol 法提取擬南芥葉片總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以該cDNA 為模板，82CDS–F/82CDS–R 為引物，擴(kuò)增得到AtCS82 基因的全長(zhǎng)CDS。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)后切膠回收并純化，然后使用pMD?19–T Vector 試劑盒連接到pMD19–T 載體上，構(gòu)成pMD19–T–AtCS82 載體。采用熱激法[17]將此載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α 中，挑選陽(yáng)性克隆送博尚生物公司測(cè)序。

1.3.2 載體連接及農(nóng)桿菌GV3101 的轉(zhuǎn)化

用XbaI 和SacI 限制性內(nèi)切酶分別對(duì)pMD19– T–AtCS82 和pCAMBIA1300–35S 載體進(jìn)行雙酶切。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)后分別回收目的片段和目的載體。用Rapid DNA Ligation Kit 試劑盒將AtCS82 全長(zhǎng)CDS 連接至pCAMBIA 1300–35S載體的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建pCAMBIA 1300–35S::CS82過(guò)表達(dá)載體。采用凍融法[17]將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101 中，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR 鑒定和雙酶切鑒定。

1.4 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定

挑取經(jīng)驗(yàn)證已轉(zhuǎn)入pCAMBIA1300–35S::CS82過(guò)表達(dá)載體的陽(yáng)性根癌農(nóng)桿菌單菌落于含有卡那霉素(50 mg/L)、慶大霉素(30 mg/L)和利福平(100 mg/L)的YEB 液體培養(yǎng)基中活化，采用浸花法[17]轉(zhuǎn)化Col 野生型擬南芥，并收獲T0代種子。將收獲的T0代種子鋪在含有潮霉素(20 mg/mL)的MS 固體培養(yǎng)基上，待植株生長(zhǎng)15 d 后，將抗性植株移栽至蛭石中。為了檢測(cè)目的片段是否已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)化子的基因組上，根據(jù)pCAMBIA1300–35S::CS82 載體序列信息，設(shè)計(jì)1 對(duì)檢測(cè)引物，序列分別為：1300JC– F，5'–GACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTT–3'；1300JC–R，5'–TCACGGTTTAGGCCCG–3'。

用CTAB 法[17]提取抗性植株總DNA，以此作模板，用1300JC–F/1300JC–R 進(jìn)行PCR 檢測(cè)，鑒定轉(zhuǎn)化子。

2 結(jié)果與分析

2.1 T–DNA 插入純合突變體的篩選結(jié)果

2.1.1 AtCS82 基因在擬南芥不同組織的表達(dá)情況

擬南芥不同組織中AtCS82 表達(dá)情況分析的電泳結(jié)果(圖1)表明，AtCS82 在4 d 和7 d 的果莢中表達(dá)量較高，其中在7 d 果莢中的表達(dá)量又稍高于4 d果莢的表達(dá)量，而在莖、葉、花中的表達(dá)量明顯偏低；因此，在對(duì)純合突變體植株的RT–PCR 驗(yàn)證試驗(yàn)中，將采用生長(zhǎng)7 d 的果莢作為試驗(yàn)材料。

圖1 擬南芥不同組織中AtCS82 基因表達(dá)分析的電泳結(jié)果Fig.1 Expression analysis for AtCS82 gene in different tissues

2.1.2 突變體植株DNA 水平的檢測(cè)結(jié)果

從T–DNA 插入突變體植株DNA 水平檢測(cè)的PCR 產(chǎn)物凝膠電泳圖譜(圖2)可知，作為對(duì)照的Col型植株由于沒(méi)有T–DNA 插入，只有以LP/RP 為引物時(shí)才有擴(kuò)增條帶，以BP/RP 為引物時(shí)沒(méi)有擴(kuò)增條帶；受試的10 個(gè)AtCS82 基因T–DNA 插入突變植株中，cs82–1～cs82–8 只有以BP/RP 為引物時(shí)才有擴(kuò)增條帶，而cs82–9、cs82–10 以LP/RP 和BP/RP這2 對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)均有擴(kuò)增條帶。這一結(jié)果說(shuō)明，cs82–1～cs82–8 為AtCS82 基因T–DNA 插入純合突變體，cs82–9、cs82–10 為AtCS82 基因T–DNA插入雜合突變體。

圖2 cs82 純合突變體PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR detection of cs82 homozygous mutants

2.1.3 RT–PCR 驗(yàn)證結(jié)果

初步鑒定出的純合突變體cs82–1～cs82–7 的RT–PCR 電泳結(jié)果(圖3)顯示，作為對(duì)照的Col 野生型擬南芥有擴(kuò)增產(chǎn)物，與其比較，有6 株純合突變體(cs82–1～cs82–6)有明顯擴(kuò)增產(chǎn)物，而cs82–7 沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物。這一結(jié)果說(shuō)明，在cs82–7 植株中AtCS82 基因的表達(dá)因T–DNA 插入而被完全沉默。將驗(yàn)證后的cs82–1～cs82–7 植株繼續(xù)培養(yǎng)，分單株收取種子，分別標(biāo)注、保存、備用，其中cs82–7 純合突變體經(jīng)DNA 水平檢測(cè)和RT–PCR 檢測(cè)，證實(shí)為AtCS82 表達(dá)完全沉默的純合突變體，可以作為研究 AtCS82 基因?qū)χ参锷L(zhǎng)發(fā)育的影響的試驗(yàn)材料。

圖3 純合突變體內(nèi)AtCS82 基因的轉(zhuǎn)錄情況Fig.3 AtCS82 gene transcription of the homozygous mutants

2.2 AtCS82 基因過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

2.2.1 目的片段的克隆結(jié)果

AtCS82 全長(zhǎng)CDS 的PCR 電泳結(jié)果(圖4)表明，擴(kuò)增得到了約400～500 bp 的產(chǎn)物條帶，其大小與預(yù)期的AtCS82 基因全長(zhǎng)CDS 長(zhǎng)度432 bp 一致。

圖4 AtCS82 全長(zhǎng)CDS 的克隆結(jié)果Fig. 4 Cloning of AtCS82 full length CDS

圖5 序列比對(duì)結(jié)果Fig. 5 Result of sequence alignment

測(cè)序結(jié)果(圖5)表明，擴(kuò)增產(chǎn)物與TAIR 網(wǎng)站上公布的AtCS82 基因全長(zhǎng)CDS 序列同源性為100%，表明克隆結(jié)果正確，可以用于下一步試驗(yàn)。

2.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果

農(nóng)桿菌GV3101 單菌落的PCR 結(jié)果(圖6)表明，所挑取的7 個(gè)單菌落均為已轉(zhuǎn)入pCAMBIA1300– 35S::CS82 過(guò)表達(dá)載體的陽(yáng)性菌落。

圖6 根癌農(nóng)桿菌GV3101 菌落PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 PCR detection of Agrobacterium tumefaciens GV3101 colonies after transfection

用XbaI 和SacI 限制性內(nèi)切酶雙酶切重組質(zhì)粒，得到1 條大小約為400～500 bp 的條帶(圖7)，這與預(yù)期條帶的大小相符，表明pCAMBIA1300– 35S::CS82 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖7 重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證結(jié)果Fig. 7 Identification of recombinant vector by restriction enzyme digestion

2.3 轉(zhuǎn)化子的獲得和鑒定

從含有潮霉素的MS 培養(yǎng)基上篩選出抗性苗5株(35S::CS82–1～35S::CS82–5)。PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果(圖8)顯示，Col 野生型沒(méi)有出現(xiàn)條帶，而5 株轉(zhuǎn)基因植株(1～5 號(hào)泳道)的PCR 產(chǎn)物條帶大小與陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照(7 號(hào)泳道)的PCR 產(chǎn)物片段一致，證明獲得了5 株轉(zhuǎn)基因植株。

圖8 抗性植株的PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig. 8 PCR identification of transgenic plants with hygromycin-resistance

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的過(guò)表達(dá)分析

轉(zhuǎn)基因植株的過(guò)表達(dá)分析電泳結(jié)果(圖9)顯示，AtCS82基因在5株轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)明顯高于野生型植株，說(shuō)明AtCS82 基因在CaMV35S 強(qiáng)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下在轉(zhuǎn)基因植株中得到了過(guò)表達(dá)。

圖9 AtCS82 基因表達(dá)水平的RT–PCR 分析Fig. 9 RT–PCR analysis of AtCS82 expression

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)T–DNA 插入突變體的篩選，獲得了穩(wěn)定遺傳的AtCS82 基因沉默純合突變體株系，通過(guò)構(gòu)建pCAMBIA1300–35S::CS82 過(guò)表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化Col 的方式獲得了穩(wěn)定遺傳的AtCS82 基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。

在本研究中，為了獲得AtCS82 基因沉默的純合突變體，對(duì)購(gòu)買的T–DNA 插入突變體材料cs82進(jìn)行了DNA 水平檢測(cè)和RT–PCR 檢測(cè)。DNA 水平檢測(cè)獲得了8 株純合突變體(cs82–1～cs82–8)，而經(jīng)過(guò)RT–PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)僅有1 株純合突變體(cs82–7)中AtCS82 基因的表達(dá)因T–DNA 插入而被完全沉默。從理論上講，由于T–DNA 插入的片段較大，通過(guò)T–DNA 插入技術(shù)得到的純合突變體往往能夠有效的使基因處于沉默狀態(tài)，但本試驗(yàn)中只有cs82–7 中AtCS82 基因的表達(dá)因T–DNA 插入而被完全沉默，其他純合突變體中仍有一定水平的表達(dá)。為了確認(rèn)這一結(jié)果不是由于RT–PCR 操作不當(dāng)而造成的假性現(xiàn)象，對(duì)受試植株重新取花后生長(zhǎng)5 d 的果莢，分離RNA，再次進(jìn)行RT–PCR 檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果與7 d 果莢的RT–PCR 結(jié)果一致，且2 次試驗(yàn)中擬南芥Actin 基因表達(dá)的擴(kuò)增結(jié)果證明所分離的RNA 質(zhì)量很好，說(shuō)明cs82–7 植株中的AtCS82 基因確實(shí)被有效沉默。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

采用RT–PCR 對(duì)AtCS82 基因在擬南芥中不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析的結(jié)果表明，AtCS82 基因在4 d 和7 d 的果莢中表達(dá)量較高，而在莖、葉、花中的表達(dá)量明顯偏低，推測(cè)AtCS82 基因可能參與種子發(fā)育。由于AtCS82 基因是通過(guò)篩選比對(duì)油菜種子發(fā)育中同化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化2 個(gè)關(guān)鍵時(shí)期的SSH 文庫(kù)中的EST 序列而得到的，在后續(xù)對(duì)AtCS82 基因功能的研究中，可以側(cè)重于探討AtCS82 基因是否參與擬南芥脂肪酸的代謝調(diào)控。

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