基于化學成分和致香物質(zhì)的烤煙上部葉香型判別分析

詹軍，周芳芳，鄧國賓，毛春堂，包崇彥，饒駿晨，張曉龍

(云南瑞升煙草技術(shù)(集團)有限公司，云南 昆明650106)

特色煙葉的研發(fā)過程，實際上就是對各地煙葉質(zhì)量特征進行挖掘、提煉、特色定位和定向彰顯的過程[1]。香型既是煙葉風格特征的重要標識，也是煙葉特色的重要內(nèi)容[2]，國內(nèi)各卷煙品牌產(chǎn)品風格特色主要依靠不同產(chǎn)地、不同等級煙葉配伍形成，香型在很大程度上影響著烤煙的風格特色。煙葉香型除了與遺傳特性有關(guān)外[3]，還與氣候、地形、土壤以及醇化調(diào)制等相關(guān)[4–5]，最終決定烤煙香型的是烤煙的化學成分和致香物質(zhì)的組成、含量及比例。目前在判斷烤煙品質(zhì)和可用性上主要以碳水化合物、含氮化合物、礦物質(zhì)等常規(guī)化學成分為主[6–7]。竇玉青等[7]研究指出，不同香型煙葉的主要化學成分含量、糖堿比、氮堿比、兩糖比有很大差異。席元肖等[8]研究發(fā)現(xiàn)，濃香型烤煙總植物堿、氯、淀粉、石油醚提取物含量和綠原酸含量顯著較高，中間香型和清香型烤煙的總糖和還原糖含量顯著高于濃香型；清香型烤煙葉黃素、β–胡蘿卜素和類胡蘿卜素含量較高。探討香型風格量化指標的研究[9–11]日益增多。判別分析[12–15]在烤煙品質(zhì)研究上取得了一定成果[16–20]，但這些研究的指標多集中于常規(guī)化學成分，且樣本來源地較為狹窄。筆者以中國11 個主要產(chǎn)煙省的烤后B2F 煙葉的67 種物質(zhì)(常規(guī)化學成分5 種，致香物質(zhì)62 種)含量為指標，采用Fisher 逐步判別分析，構(gòu)建了不同香型烤煙上部葉樣品的Fisher 判別函數(shù)，并對數(shù)學模型進行全面評價，以期揭示不同香型烤煙上部葉內(nèi)在化學成分和致香物質(zhì)狀況，為烤煙香型風格的特征分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料來自于2011年11 個主要產(chǎn)煙省的13個地區(qū)，分別為遼寧開原、四川會理、湖北?？?、重慶武隆、廣東南雄、山東諸城、河南洛陽、福建武夷山、湖南瀏陽、貴州綏陽和畢節(jié)、云南楚雄和馬龍。共選取B2F 煙樣84 份(校正樣品65 份，驗證樣品19 份)。校正樣品中濃香型20 份，中間香型17份，清香型28 份；驗證樣品中濃香型6 份，中間香型5 份，清香型8 份。為保證樣品的代表性，每份樣品均由該產(chǎn)地6～8 個代表點的煙葉混合而成，樣品混勻后，將每片煙葉均切去葉尖部和葉基部各1/3部分后，沿主脈一分為二，一半煙葉除去主葉脈后粉碎過0.250 mm 孔徑篩，測定化學成分和致香物質(zhì)含量；另一半煙葉切絲混勻卷煙作為評吸樣品。

1.2 方 法

1.2.1 煙葉香型鑒定

單料煙的感官評吸及香型鑒定參照文獻[21]，其中香氣類型分為濃香型(包括濃偏中、中偏濃)、中間香型、清香型(包括清偏中、中偏清)。

1.2.2 致香物質(zhì)提取及定性定量分析

致香物質(zhì)的測定采用GC/MS 法，氣質(zhì)聯(lián)用分析儀(Agilent GC6890N/MS5975I)為美國安捷倫公司生產(chǎn)。致香物質(zhì)的樣品前處理與GC/MS 分析測定條件參照文獻[22]的方法進行，其內(nèi)標物為萘。

1.2.3 化學成分含量測定

化學成分的測定：試樣的制備(YC/T 31–1996)；煙堿(YC/T 159–2002)；總糖、還原糖(YC/T 160–2002)；總氮(YC/T 162– 2002)；蛋白質(zhì) (YC/T 249–2008)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析使用Microsoft Excel 2003和SPSS 17.0。判別分析采用Fisher 逐步判別[23]，進入模型的F=3.84，移出模型的F=2。

2 結(jié)果與分析

2.1 烤煙主要化學成分和致香物質(zhì)的基本描述統(tǒng)計

65 個樣本的67 種物質(zhì)的描述統(tǒng)計結(jié)果見表1和表2。由表1 和表2 可以看出，各物質(zhì)含量的變幅較大，這主要由不同香型烤煙中各物質(zhì)含量的差異所致。在致香物質(zhì)中，含量超過1 μg/g 的從大到小依次為新植二烯、十六酸、茄酮、西柏三烯二醇、巨豆三烯酮、亞麻酸甲酯、金合歡基丙酮、苯甲醇、β–大馬酮、寸拜醇、β–紫羅蘭酮、植醇、苯乙醇、十六酸甲酯、3–(1–甲基乙基)(1H)吡唑[3，4–b]吡嗪、2–甲氧基–4–乙烯基苯酚、糠醛、香葉基丙酮、β–二氫大馬酮、十四醛、十六酸乙酯、二氫獼猴桃內(nèi)酯等，其中質(zhì)體色素降解產(chǎn)物9 種，苯丙氨酸類3 種，美拉德反應產(chǎn)物2 種，類西柏烷類2 種，其他類6種。其他類中，酯類3 種，酸類、醇類、醛類各1種。由偏度系數(shù)、峰度系數(shù)和K–S 檢驗概率可以看出，只有1–戊烯–3–酮、2–環(huán)戊烯–1，4–二酮、5–甲基糠醛、巨豆三烯酮、圓柚酮、西柏三烯二醇等不符合正態(tài)分布，其他大部分指標接近正態(tài)分布。

表1 烤煙主要化學成分描述統(tǒng)計Table 1 Descriptive statistics of neutral aroma components from flue-cured tobacco

表2 烤煙主要致香物質(zhì)描述統(tǒng)計Table 2 Descriptive statistics of main aroma components from flue–cured tobacco

續(xù) 表

2.2 不同香型烤煙主要化學成分和致香物質(zhì)的含量

不同香型烤煙的化學成分和致香物質(zhì)含量見表3。中間香型烤煙致香物質(zhì)總量最高，清香型其次，濃香型最低，中間香型烤煙致香物質(zhì)總含量顯著高于濃香型，清香型和濃香型烤煙致香物質(zhì)含量的差異均不顯著。清香型烤煙中有20 種致香物質(zhì)含量較高，中間香型中有21 種，濃香型中有22 種。清香型烤煙中常規(guī)化學成分總糖、總氮、還原糖、蛋白質(zhì)含量均較高，其中總糖、還原糖含量極顯著(P＜0.01)高于中間型和濃香型烤煙，濃香型烤煙中煙堿含量最高。3 種香型烤煙中，只有3–羥基–2–丁酮、亞麻酸甲酯含量呈顯著差異(P＜0.05)，吡啶、糠醇、丁內(nèi)酯、2–吡啶甲醛、苯甲醇、2–乙?；C3，4，5，6–四氫吡啶、1–(1H–吡咯–2–基) –乙酮、1–(3–吡啶基) –乙酮、苯并[c]噻酚、吲哚、2–甲氧基–4–乙烯基苯酚、β–大馬酮、β–紫羅蘭酮、3–(1–甲基乙基)(1H)吡唑[3，4–b]吡嗪、2，3'–聯(lián)吡啶、巨豆三烯酮、十四醛、金合歡基丙酮、十六酸、植醇等20種物質(zhì)的含量無顯著差異；中間香型烤煙中3–甲基–1–丁醇含量最高，濃香型烤煙中則極顯著低于清香型和中間香型；濃香型烤煙的2，4–庚二烯醛含量極顯著高于中間型，但與清香型烤煙的含量差異不顯著；中間香型中的2–乙基吡啶、壬醛含量極顯著高于清香型和濃香型；苯乙醇含量以中間香型顯著低于另2 個香型，而胡薄荷酮含量以濃香型烤煙極顯著低于中間香型，而清香型和中間香型的差異不顯著；丁基化羥基甲苯含量以清香型最高，極顯著高于濃香型，顯著高于中間香型；濃香型烤煙的3–氧代–α–紫羅蘭醇含量顯著高于清香型和中間香型，而清香型和中間香型之間差異不顯著。另外，中間香型烤煙致香物質(zhì)含量和比例最高的新植二烯含量極顯著高于清香型和濃香型烤煙，而清香型和濃香型烤煙之間差異不顯著(P＞0.05)。

表3 不同香型烤煙的主要化學成分和致香物質(zhì)含量Table 3 Contents of chemical constituents and aroma components of flue-cured tobacco in different aroma types

續(xù) 表

2.3 烤煙主要化學成分和致香物質(zhì)檢驗

通過對烤煙主要化學成分和致香物質(zhì)進行簡單相關(guān)分析(限于篇幅而未予以列出)，發(fā)現(xiàn)只有糠醛和糠醇(0.818)、2–環(huán)戊烯–1，4–二酮和1–(1H–吡咯–2–基)–乙酮(0.845)、苯甲醇和苯乙醇(0.823)、β–紫羅蘭酮(0.803)、寸拜醇和亞麻酸甲酯(0.913)等指標間的相關(guān)系數(shù)大于0.8，其余各指標間的相關(guān)系數(shù)均小于0.800，說明大部分指標之間不存在多重共線性。另外，通過進行類均值相等檢驗(表4)發(fā)現(xiàn)，只有x1、x9、x12、x15、x18、x19、x23、x27、x29、x30、x33、x38、x39、x42、x43、x45、x50、x51、x52、x55、x60、x62、x66等指標的類內(nèi)均值差異不顯著，其他物質(zhì)的類內(nèi)均值都存在顯著性差異。通過對協(xié)方差矩陣相等進行檢驗，發(fā)現(xiàn)其Box's M 的統(tǒng)計量值為455.265，遠大于0.05，認為在顯著水平0.05 條件下各類協(xié)方差矩陣相等，而F 檢驗的顯著性概率Sig.=0.000，遠小于0.05，從而認為判別分析是顯著的，說明錯判率將很小。

由以上分析可知，烤煙主要中性致香物質(zhì)指標基本上服從正態(tài)分布且相關(guān)性較弱，大部分變量的類內(nèi)均值存在顯著性差異，且各類的協(xié)防差矩陣相等，說明進行判別分析有意義，且錯判率將很低。

表4 烤煙主要化學成分和致香物質(zhì)的類均值相等檢驗結(jié)果Table 4 Test of equality of group means of chemical constituents and aroma components of flue-cured tobacco

2.4 不同香型烤煙的中性致香物質(zhì)的判別分析

2.4.1 判別函數(shù)的建立

對烤煙上部葉67 種物質(zhì)含量進行逐步判別分析，最終引入判別函數(shù)的有12 種，55 種被剔除。引入判別函數(shù)的12 種物質(zhì)為總糖、還原糖、3–甲基–1–丁醇、2–吡啶甲醛、2，4–庚二烯醛、2–乙基吡啶、壬醛、苯乙醇、苯并[c]噻酚、胡薄荷酮、丁基化羥基甲苯、3–氧代–α–紫羅蘭醇。最終得到2個典型判別函數(shù)為：

2 個典型判別函數(shù)的特征值分別為9.046 和6.876，能解釋模型方差變化的56.8%和43.2%，可見進入方程的12 種物質(zhì)可以反映各烤煙香型的特征。通過對判別函數(shù)進行顯著性檢驗，其Wilks′ λ值分別為0.013 和0.127，均非常小，卡方統(tǒng)計量值分別為246.962 和116.605，顯著性概率均為0.000，從而認為判別函數(shù)有效。3 種香型烤煙上部葉樣品在前2 個判別函數(shù)中的得分見圖1。從圖1 中可以看出，在空間上能夠很好地將3 種香型的烤煙樣本區(qū)分開來。為了更好地對未知樣品的香氣類型進行判斷、識別和描述，建立了3 個Fisher 判別函數(shù)。

圖1 樣品在2 個判別函數(shù)中的得分Fig.1 The scores of samples in previous two discriminant function

2.4.2 判別效果的檢驗

用自身驗證法和交互驗證法對原樣品進行回判，結(jié)果(表5)表明，自身驗證法對清香型、中間香型、濃香型烤煙香型的判對率均為100%；交互驗證法的判對率依次為100%、100%、95%，交互驗證的回判準確率為98.33%，判別效果較好，判別分析有意義。

表5 不同香型烤煙回判分析結(jié)果Table 5 The results of re-discrimination of different flue-cured tobacco aroma types

2.4.3 判別預測

為了更好地檢驗判別模型的準確性，分別用8個清香型、5 個中間香型、6 個濃香型驗證樣品用于檢驗，結(jié)果(表6)可以看出，清香型烤煙中有1 個樣品被判為濃香型，其判對率為83.33%；另2 個香型烤煙的判對率均為100%；所有樣品的判別準確率達94.44%，準確率較高，說明該判別模型有著較好的實際預測效果和應用價值。

表6 各香型烤煙預測樣本的判別結(jié)果Table 6 Discriminatory results for tobacco samples predicted to be different aroma types

續(xù) 表

3 結(jié)論與討論

香型體現(xiàn)中式卷煙風格特色，是進行煙葉品質(zhì)區(qū)域劃分的重要依據(jù)，對制訂生產(chǎn)技術(shù)措施、實施標準化生產(chǎn)具指導作用[2]。長期以來，對煙草香氣質(zhì)量及香型的評價一直建立在評吸人員對煙葉燃燒所形成煙氣的感官評價上[24]，但是煙葉的品質(zhì)和香型歸根結(jié)底是由其內(nèi)在化學成分和致香物質(zhì)決定的，烤煙香吃味品質(zhì)是其各種內(nèi)在化學成分平衡協(xié)調(diào)的結(jié)果，香氣物質(zhì)的含量并不是越高越好，片面提高某些香氣成分含量，并不一定能提高烤煙香吃味品質(zhì)[25]。可見，烤煙的香型不僅與香氣物質(zhì)的絕對含量有關(guān)，更與各種香氣成分之間、與其他化學成分之間的比例和作用有關(guān)[12,22]。此外，致香物質(zhì)因為其官能團和相對分子質(zhì)量不同，其沸點、熔點等理化指標也會有所不同，可能會對感官評吸產(chǎn)生較大的影響，并影響到香型的判斷。本研究結(jié)果表明，中間香型烤煙的致香物質(zhì)總量最高，清香型其次，濃香型最低，且中間香型含量顯著高于濃香型，而清香型含量與中間香型和濃香型的差異均不顯著，而3 種香型烤煙中，含量最高的致香物質(zhì)種類差異很小，且清香型烤煙的總糖和還原糖含量極顯著高于另2 個香型，判別分析篩選出的12 個指標在不同香型烤煙間有顯著或極顯著差異，但并不是每個香型之間均有顯著差異，可見主導某種香型的化學成分和致香物質(zhì)會有所不同。在判別分析中發(fā)現(xiàn)各有1 個濃香型樣品在交叉驗證和回判檢驗時被判為清香型，交叉驗證時被誤判的樣品來自山東諸城，回判檢驗時被誤判的樣品來自河南洛陽，而這2 個原始樣品在進行感官評吸時其香韻均呈現(xiàn)一定的濃透清，可能是樣品雖然來自同一地區(qū)，但是其生態(tài)條件有明顯的差異，最終導致了同一地區(qū)的樣品具有不同的香韻，可見在同一地區(qū)烤煙的香型具有一定的多樣性和差異性。

通過Fisher 逐步判別分析，構(gòu)建了包含有12 個指標(總糖、還原糖、3–甲基–1–丁醇、2–吡啶甲醛、2，4–庚二烯醛、2–乙基吡啶、壬醛、苯乙醇、苯并[c]噻酚、胡薄荷酮、丁基化羥基甲苯、3–氧代–α–紫羅蘭醇)的判別函數(shù)模型，并以自身驗證法對該模型進行驗證，其結(jié)果顯示3 種香型烤煙上部葉的判別準確率均為100%；采用交互驗證法進行檢驗，對其的判對率依次為100%(清香型)、100%(中間香型)、95%(濃香型)，總體的判對率為98.33%；對19 個驗證樣品的判別檢驗判對率分別為100%(清香型)，100%(中間香型)，83.33%(濃香型)，整體的判斷準確率為94.44%。該判別函數(shù)模型的回顧性和前瞻性檢驗結(jié)果表明，該模型的判別準確度高、效果好，具有較高的精確性和實際可用性，可以在實際生產(chǎn)中對煙葉原料進行快速、客觀、準確地鑒別，從而更好地指導煙葉原料生產(chǎn)和葉組配方。

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