向川安癭蜂和寄生性長(zhǎng)尾小蜂共生菌Wolbachia 的檢測(cè)

楊筱慧，朱道弘*，劉志偉，蘇成元

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)昆蟲(chóng)行為與進(jìn)化生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.東伊利諾大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，查爾斯頓，伊利諾伊州，美國(guó)，61920)

Wolbachia 是一類(lèi)能調(diào)控被感染宿主生殖方式、與宿主共生的胞質(zhì)遺傳的生殖共生菌，屬變形菌綱的a 亞綱。Wolbachia 的調(diào)控方式包括誘導(dǎo)宿主胞質(zhì)不親和(cytoplasmic incompatibility)、誘導(dǎo)孤雌生殖(parthenogenesis-inducing)、誘導(dǎo)雌性化(feminizing)及雄性致死(male-killing)等[1–3]。

一些學(xué)者認(rèn)為，Wolbachia 主要通過(guò)雌性宿主生殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)傳遞給子代，傳播方式為種內(nèi)垂直傳播[1]。但有分子生物學(xué)研究表明，Wolbachia 和其昆蟲(chóng)宿主二者的分子系統(tǒng)樹(shù)并不一致，說(shuō)明在一些宿主中存在Wolbachia 的水平傳播[4]。當(dāng)感染和未感染W(wǎng)olbachia 的赤眼蜂幼蟲(chóng)共享一宿主的卵時(shí)，兩類(lèi)幼蟲(chóng)間發(fā)生了Wolbachia 的水平傳播[5]。另外，利用顯微注射還實(shí)現(xiàn)了Wolbachia在寄主間的水平傳播[6]。已發(fā)現(xiàn)的Wolbachia 的水平傳播途徑有宿主–寄生蜂、血液接觸、取食、植物介導(dǎo)等4 種，其中宿主–寄生蜂間水平傳播報(bào)道最多，如發(fā)現(xiàn)原麗蠅–金小蜂[7]和果蠅–寄生蜂[8–9]等宿主與寄生蜂Wolbachia 的wsp或ftsz 基因的DNA 序列完全一致。

癭蜂科屬癭蜂總科(Cynipoidea)，分兩亞科，即Hodiernocynipinae( 均為化石種) 和癭蜂亞科Cynipinae(現(xiàn)存種和個(gè)別化石種)。癭蜂亞科包含Aylacini 族、Eschatocerin 族、Diplolepidini 族、Synergini 族、Pediaspidili 族及Cynipini 族等[10]。癭蜂具有產(chǎn)雄孤雌生殖 (arrhenotoky)、產(chǎn)雌孤雌生殖 (thelyotoky)、周期性的孤雌生殖(cyclical partheno- genesis) 等多種繁殖方式。研究已證明，Aylacini族、Diplolepidini 族、Synergini 族和Cynipini 族分別有4、9、11、6 種癭蜂感染W(wǎng)olbachia[11–16]，而感染W(wǎng)olbachia 的Cynipini 族一些種類(lèi)的產(chǎn)雌孤雌生殖已證實(shí)不是由Wolbachia 誘導(dǎo)[11,15,16]。

向川安癭蜂(Andricus mukaigawae)屬Cynipini族，分布于俄羅斯、中國(guó)、韓國(guó)、日本和印度，于槲櫟(Quercus aliena)等殼斗科植物的枝條形成球狀蟲(chóng)癭[17]。Abe 和Miura 已證實(shí)向川安癭蜂的日本種群存在Wolbachia 的共生，但其產(chǎn)雌孤雌生殖與Wolbachia 的共生無(wú)關(guān)[11]。

筆者于2011年11月從安徽安慶采集向川安癭蜂蟲(chóng)癭，并收集向川安癭蜂和寄生蜂–長(zhǎng)尾小蜂(Torymus sp.)，使用Wolbachia 的細(xì)胞表面蛋白wsp基因的特異引物，通過(guò)PCR 法擴(kuò)增向川安癭蜂和寄生蜂Wolbachia 的wsp 特異片段，并建立Wolbachia的wsp 基因的分子系統(tǒng)樹(shù)，以證實(shí)Wolbachia 對(duì)中國(guó)安慶地區(qū)向川安癭蜂和其寄生蜂長(zhǎng)尾小蜂的感染，推測(cè)向川安癭蜂和寄生蜂間Wolbachia 的傳播方式。

1 材料與方法

1.1 材 料

于2011年11月自安徽安慶采集向川安癭蜂蟲(chóng)癭，寄主植物為白櫟(Quercus fabri Hance)。室溫條件下置于養(yǎng)蟲(chóng)籠內(nèi)，2011年12月下旬至2012年2月上旬獲得向川安癭蜂羽化成蟲(chóng)； 2012年3月上旬至2012年5月上旬獲得寄生蜂羽化成蟲(chóng)。成蟲(chóng)樣本以無(wú)水乙醇浸泡，于– 40 ℃冰柜保存，備用。

1.2 方 法

1.2.1 總DNA 提取及Wolbachia 感染的檢測(cè)和測(cè)序

以酚–氯仿法[15]提取向川安癭蜂和長(zhǎng)尾小蜂雌成蟲(chóng)總DNA，樣本各10 個(gè)。

以節(jié)肢動(dòng)物 CO–I 特異引物 LCO1490 和HCO2198[18]對(duì)樣本的模板DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)DNA 模板質(zhì)量，CO–I PCR 擴(kuò)增體系、條件參考Folmer 等[18]的方法，獲得的PCR 產(chǎn)物大小約為660 bp。陽(yáng)性結(jié)果的DNA 模板用于檢測(cè)Wolbachia。

Wolbachia 的wsp 基因片段用細(xì)胞表面蛋白基因wsp 片段的特異引物wsp81F 和wsp691R[19]進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以檢測(cè)向川安癭蜂和長(zhǎng)尾小蜂Wolbachia 的感染。wsp PCR 擴(kuò)增體系和條件參考文獻(xiàn)[16]的方法，獲得PCR 產(chǎn)物大小約為600 bp。陽(yáng)性對(duì)照是已知感染W(wǎng)olbachia 的栗癭蜂，陰性對(duì)照是未感染的栗癭蜂和純凈水。

對(duì)Wolbachia 的wsp 基因的PCR 產(chǎn)物直接雙向測(cè)序由上海英駿生物有限公司完成。

1.2.2 Wolbachia 系統(tǒng)發(fā)生分析

寄生蜂、宿主向川安癭蜂和其他昆蟲(chóng)的Wolbachia 的wsp 基因序列利用軟件Clustal X 2.0[20]對(duì)齊排列。由于該基因序列74～110、214～249 和520～584 位區(qū)域的同源性在部分研究中存在歧義[19]，故將這3 個(gè)區(qū)域刪除。Wolbachia 的wsp 基因的進(jìn)化模型利用Model–Test 3.7[21]程序篩選，wsp 基因的最合適的進(jìn)化模型為(GTR+G)模型。鄰位相連(neighbor–joining method)NJ 系 統(tǒng) 樹(shù) 使 用 軟 件MEGA[22]、依據(jù)(GTR+G) 模型設(shè)定參數(shù)值、采用Kimura′s 2–parameter 遺傳距離構(gòu)建，自導(dǎo)復(fù)制次數(shù)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 向川安癭蜂和長(zhǎng)尾小蜂的性比及Wolbachia感染率

共采集到295 個(gè)向川安癭蜂蟲(chóng)癭，收集到向川安癭蜂成蟲(chóng)共52 只，全部為雌性，通過(guò)檢測(cè)其體內(nèi)Wolbachia，感染率為30%。收集到長(zhǎng)尾小蜂雌成蟲(chóng)18 個(gè)，雄性成蟲(chóng)6 個(gè)，雌性比例為75%，檢測(cè)其體內(nèi)Wolbachia，感染率為100%。

2.2 向川安癭蜂和長(zhǎng)尾小蜂與已知癭蜂Wolbachia的wsp 基因的序列一致性

測(cè)序結(jié)果表明，寄主向川安癭蜂感染了Wa株系，寄生的長(zhǎng)尾小蜂感染了Wb株系，其GenBank登錄號(hào)分別為KC130968 和KC130977(表1)。使用NCBI 網(wǎng)站的Blast 工具，對(duì)向川安癭蜂、長(zhǎng)尾小蜂和GenBank 已登錄的癭蜂及其他代表性昆蟲(chóng)種類(lèi)的Wolbachia 的wsp 基因序列進(jìn)行一致性比較，基因序列的一致性最低為81%，最高為99%。

表1 向川安癭蜂群落與已知癭蜂Wolbachia 的wsp 基因序列的一致性Table 1 Sequence identity of the wsp gene of Wolbachia from A. mukaigawae and Torymus sp. with other species of Cynipidae

2.3 Wolbachia 的分子系統(tǒng)樹(shù)

由Wolbachia 的wsp 基因建立的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(圖1)可知，獲得的向川安癭蜂和寄生長(zhǎng)尾小蜂的Wolbachia 株系均屬A 群，與膜翅目其他種類(lèi)[23]和其他癭蜂Wolbachia 的結(jié)果一致，其中，Wa和S.gallaepomiformis (AY095155)的wsp 序列基本一致(相差1 個(gè)堿基)，Wb未與其他分支聚合，獨(dú)立為1 個(gè)分支；Wa和Wb為不同株系。

圖1 向川安癭蜂、長(zhǎng)尾小蜂和其他癭蜂Wolbachia 的wsp 基因序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系Fig. 1 Phylogenetic relationship of wsp gene sequences of Wolbachia in A. mukaigawae and Torymus sp. and other gall wasps

3 討 論

癭蜂的生殖方式主要為有性和無(wú)性世代交替發(fā)生，稱(chēng)為周期性孤雌生殖或世代交替(heterogony)[24]。櫟癭蜂族癭蜂1年發(fā)生1 個(gè)世代，有性和無(wú)性世代交替發(fā)生。對(duì)于櫟癭蜂族癭蜂的產(chǎn)雌孤雌生殖，Abe 等認(rèn)為，癭蜂周期性孤雌生殖中兩性生殖世代的丟失是Wolbachia 的控制所致[25]。Plantard 等對(duì)薔薇癭蜂(Diplolepis spinosissimae )10個(gè)地理種群的性比、遺傳結(jié)構(gòu)及Wolbachia 感染檢測(cè)的研究，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)地理種群無(wú)Wolbachia 的共生，為產(chǎn)雄孤雌生殖；8 個(gè)地理種群有Wolbachia 的共生，為Wolbachia 誘導(dǎo)產(chǎn)雌孤雌生殖[12]。然而，Zhu 等[15]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)雌孤雌生殖的栗癭蜂(Dryocosmus kuriphilus)(櫟癭蜂族)被Wolbachia 感染，但其孤雌生殖并非Wolbachia 所誘導(dǎo)；同屬櫟癭蜂族的向川安癭蜂[11]、麥?zhǔn)习舶`蜂[16]盡管感染了Wolbachia，但均進(jìn)行周期性的孤雌生殖；這些研究結(jié)果和Abe 等的推測(cè)并不一致。本研究證實(shí)采自中國(guó)安慶寄生的長(zhǎng)尾小蜂和宿主向川安癭蜂均感染了Wolbachia。鑒于Abe 等已證明向川安癭蜂為周期性孤雌生殖的無(wú)性世代，其下一世代為有性世代，其Wolbachia 未誘導(dǎo)向川安癭蜂的產(chǎn)雌孤雌生殖[11]，而筆者采集的樣本均為雌性，故也推測(cè)Wolbachia 未誘導(dǎo)向川安癭蜂的產(chǎn)雌孤雌生殖。長(zhǎng)尾小蜂感染了Wolbachia，但采集的樣本中有雌、雄性個(gè)體，應(yīng)為有性生殖，因此，推測(cè)其體內(nèi)Wolbachia 的共生未能誘導(dǎo)長(zhǎng)尾小蜂營(yíng)產(chǎn)雌孤雌生殖。

向川安癭蜂和寄生的長(zhǎng)尾小蜂分別感染W(wǎng)olbacia 株系Wa和Wb，其wsp 序列差異大，為不同株系，因而不能作為Wolbachia 在向川安癭蜂和寄生的長(zhǎng)尾小蜂間水平傳播的證據(jù)。但是，同一癭蜂可被不同的寄生蜂寄生，同一種寄生蜂也可寄生于不同癭蜂，鑒于未收集到其他寄生蜂，故仍不能排除Wolbachia 在癭蜂–寄生蜂間水平傳播的可能性，需采集更多的癭蜂和寄生蜂種類(lèi)，以進(jìn)一步研究Wolbachia 在癭蜂和寄生蜂間的傳播。

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