組蛋白H3賴氨酸27和36位甲基化修飾的鑒定

王國娟，張鍇*，何錫文，張玉奎，3

(1.南開大學藥物化學生物學國家重點實驗室，天津 300071;2.南開大學化學學院，天津 300071;3.中國科學院大連化學物理研究所，遼寧大連 116023)

組蛋白翻譯后修飾是一類重要的表觀遺傳學密碼［1］，它參與細胞中DNA 復制、基因轉(zhuǎn)錄、DNA 損傷修復、染色體凝聚等重要的生物過程，不僅與細胞的分化和發(fā)育密切相關，也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切聯(lián)系［2-5］。越來越多的證據(jù)表明:組蛋白翻譯后修飾將成為新一代重要的疾病標志物和藥物調(diào)控靶點［6-8］。目前已經(jīng)報道了組蛋白60多個氨基酸殘基上的至少11種翻譯后修飾形式，包括乙?；⒓谆?、丙酰化、丁酰化、磷酸化、泛素化、蘇素化等［9，10］。由于組蛋白翻譯后修飾種類繁多，且隨著細胞生理活動而動態(tài)變化，因此對傳統(tǒng)生物分析技術提出了挑戰(zhàn)。近年來，隨著高分離能力的色譜技術與高精度、高分辨率質(zhì)譜技術的迅速發(fā)展，基于質(zhì)譜技術的蛋白質(zhì)組學方法已成為組蛋白翻譯后修飾鑒定和定量分析的重要手段。

目前，基于質(zhì)譜技術的定量蛋白質(zhì)組學策略主要有:無標記的質(zhì)譜定量和基于同位素標記的質(zhì)譜定量方法。Jensen 等［11］發(fā)展了基于分析和計算機策略的無標記質(zhì)譜法，這一方法可以在多肽水平上獲得所有4個核心組蛋白翻譯后修飾的相對量。Mann 等［12］發(fā)展了SILAC 方法(stable isotope labeling by amino acids in cell culture)，將輕、重同位素標記的氨基酸分別加入不同的細胞培養(yǎng)基中，在細胞生長代謝過程中完成對不同樣本蛋白質(zhì)的同位素標記。再將不同標記的樣品按一定比例混合，平行處理后，進入質(zhì)譜檢測。通過生物信息學分析，對比輕、重同位素標記的、序列相同肽段的豐度，可以得到不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)修飾的相對定量關系。Bonenfant 等［13］利用SILAC 法相對定量了HeLa 細胞由S期到G2/M 期多種組蛋白修飾的變化，發(fā)現(xiàn)有絲分裂是細胞周期中多種修飾發(fā)生動態(tài)變化的時期。Garcia 等［14］建立了體外化學衍生同位素標記方法，改進了酶解肽段的疏水性，增加序列覆蓋率，可以用于組蛋白修飾的定量分析。

本文在對組蛋白翻譯后修飾研究中發(fā)現(xiàn)了一些氨基酸序列相同、同種修飾位于不同殘基位點的多肽組，這些多肽具有非常相近的色譜行為，通常同時從液相色譜柱上流出進入質(zhì)譜。由于它們的質(zhì)荷比(m/z)完全相同，因此在一級質(zhì)譜中難以分辨，作為同一個母離子被選取并進行碎片裂解，這導致二級碎片的復雜性增加，難以鑒定。本文采用液相色譜與質(zhì)譜技術聯(lián)合蛋白質(zhì)信息學方法，對Hela 細胞組蛋白H3賴氨酸27位和36位上的甲基化和二甲基化修飾的定量分析進行了探討。

1 實驗部分

1.1 主要試劑

改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素(均購于Thermo Scientific 生物化學制品(北京)有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS 緩沖液):0.2 g磷酸二氫鉀(KH2PO4)、0.2 g 氯化鉀(KCl)、1.14 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、8.0 g 氯化鈉(NaCl)(均購于Bio Basic Inc.)，溶解在500 mL 高純水(Millipore純水機制備)中，pH 調(diào)至7.4;乙腈和水(購于Fisher Scientific，Pittsburgh，PA，USA)，三氟乙酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，測序級胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)，μ-C18 ZipTip(Millipore，Bedford，MA，USA)。

1.2 細胞培養(yǎng)及組蛋白提取

配制含有10%(v/v)胎牛血清及1%(v/v)雙抗(青霉素、鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基。取出凍存的Hela 細胞，快速置于37℃水浴中復蘇，加入上述配好的培養(yǎng)基，將Hela 細胞均勻接種在康寧培養(yǎng)皿(d=10 cm)中，放置在37℃下、含有5%(v/v)CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，大約72 h 后，待細胞長至80%滿時，收集細胞進行組蛋白提取。

組蛋白提取詳細步驟按文獻［15］報道的方法進行。主要步驟如下:用預冷的含有5 mmol/L 丁酸鈉的PBS 溶液沖洗Hela 細胞兩次，每次10 min，離心機轉(zhuǎn)速設置為300 g;加入1 mL 蛋白提取緩沖溶液(Triton X-100 Extraction Buffer，TEB):0.5%(v/v)

Triton X-100、2 mmol/L 苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、0.2 g/L 疊氮化鈉(NaN3)，置于冰上振蕩10 min 以裂解細胞，離心，棄去上清液;在殘渣中加入0.2 mol/L H2SO4溶液(約400μL)提取組蛋白;離心并轉(zhuǎn)移上清液到新的1.5 mL 離心管中，向其中逐滴加入50%(v/v)的三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)水溶液，振蕩數(shù)次，在冰上放置30 min 使沉淀完全，然后離心棄去上清。最后分別用在4℃下預冷的0.1%(v/v)濃鹽酸/丙酮溶液和在-20℃下冰冷的100%丙酮沖洗沉淀，離心干燥獲取組蛋白。

1.3 組蛋白樣品前處理

利用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將提取的組蛋白混合樣品分離。切取目標組蛋白膠條，進行膠內(nèi)酶解［16］:蛋白凝膠條帶經(jīng)脫色、切碎、洗滌、干燥后置于含0.2μg 胰蛋白酶的50 mmol/L的碳酸氫銨溶液(pH=8.0)中，37℃下酶解過夜。提取酶解多肽，離心干燥。最后，多肽經(jīng)μ-C18 ZipTip 除鹽處理，用于后續(xù)液相色譜-質(zhì)譜分析。

1.4 HPLC/MS-MS 分析及數(shù)據(jù)搜索

采用nano-HPLC/LTQ-orbitrap 質(zhì)譜儀(Thermo，CA)進行樣品分析［17］。將酶解后的多肽溶解在10μL的緩沖溶液A(0.1%(v/v)甲酸水溶液)中，取2μL 溶解后的多肽樣品注射到Nano-HPLC 系統(tǒng)(Eksigent Technologies，Dublin，CA)中進行分離。自制毛細管柱(100 mm×75μm)填料為Jupiter C12(粒徑4μm，孔徑9 nm，Phenomenex，St.Torrance，CA)。液相色譜流動相由初始5%的緩沖溶液B(含0.1%(v/v)甲酸、95%(v/v)乙腈的水溶液)在120 min 內(nèi)線性變化至95%的緩沖液B。液相色譜分離后的多肽樣品經(jīng)由電噴霧離子源Nano-ESI 引入質(zhì)譜儀進行分析。質(zhì)譜儀采用data-dependent 模式，一次MS 掃描后進行20次的二級質(zhì)譜碎片分析。一級質(zhì)譜的掃描范圍為m/z 350～2000;采用collisionally activated dissociation(CAD)碎片裂解模式，歸一化能量為35%;全掃描的Automatic gain control(AGC)值設為1E6。所得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用Mascot軟件在NCBInr 數(shù)據(jù)庫進行搜索［18］。

2 結果與討論

2.1 組蛋白酶解多肽的鑒定

從Hela 細胞中提取出組蛋白后，采用SDSPAGE 將組蛋白混合物有效分離，酶解成多肽后，采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，借助于Mascot 軟件搜索和質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析，整體考察了Hela 細胞組蛋白H3上的翻譯后修飾圖譜。根據(jù)Mascot 數(shù)據(jù)檢索報告，結合手工分析，對鑒定到的組蛋白H3的多肽序列、修飾位點和鑒定到的數(shù)量進行了統(tǒng)計(見表1)。鑒定結果表明，Hela 細胞組蛋白H3上修飾形式復雜，一段多肽上可能有一個、兩個，甚至三個氨基酸殘基上存在修飾。二級質(zhì)譜譜圖數(shù)量的差異進一步表明:這些含有修飾的多肽豐度存在較大不同。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列27～40的肽段上賴氨酸K27和K36位點上修飾很豐富，且Kme2-SAPATGGVKmeKPHR和KmeSAPATGGVKme2KPHR的m/z 相同(都是738.44)，從液相色譜中同時流出，具有相同的保留時間，因此對它們的鑒定和定量需要進一步分析。

表1 Hela 細胞組蛋白H3多肽鑒定的統(tǒng)計Table 1 A list of all identified tryptic H3 peptides in Hela cells

2.2 H3K27和K36甲基化與二甲基化修飾的鑒定

通過分析修飾肽段的二級質(zhì)譜碎片(圖1)，并將b、y 離子的測量值與多肽序列碎片理論值進行對比，推測二級質(zhì)譜碎片可能是由兩組碎片峰疊加組成的。通過b、y 離子的歸屬分析，進一步確認了單甲基化與二甲基化修飾的修飾位點。圖1中紅色所示y5離子m/z 值為679.44，y4離子m/z 為537.33，二者相差142.1，恰好等于賴氨酸殘基(m/z 128.2)與甲基化修飾(m/z 14)之和的質(zhì)荷比，由此可知K36帶有甲基化修飾;圖1中藍色所示y5*離子的m/z 是693.45，它與y4離子的m/z 差值為156.1，剛好等于賴氨酸殘基(m/z 128.2)與二甲基化修飾(m/z 28)之和的質(zhì)荷比，由此可以確定K36帶有二甲基化修飾。采用同樣方法可以鑒定K27上的修飾。另外，根據(jù)二級質(zhì)譜圖中，二者對應的b10、b11、b13、y2、y3、y4離子的質(zhì)荷比相等，而b3、b5、y5、y7、y8、y9、y11、y12、y13離子的質(zhì)荷比相差14，可以進一步驗證這一肽段序列上兩種修飾的類型和位點。例如y8的m/z 為892.61，根據(jù)其他碎片峰的信息，綜合判斷的多肽為:“GGVKmeKPHR”;而y8*(m/z 906.65)為“GGVKme2KPHR”，二者相差一個甲基的質(zhì)荷比(m/z 14)。

2.3 H3K27和K36的甲基化與二甲基化修飾的相對豐度分析

圖1 賴氨酸27和賴氨酸36位點修飾肽段(amino acid，aa 27-40)的二級質(zhì)譜圖Fig.1 MS/MS spectrum of mixed peptide(aa 27-40)with post-translational modifications(PTMs)at K-27 and/or K-36

由于Kme2SAPATGGVKmeKPHR和KmeSAPATGGVKme2KPHR 在色譜分離時同時出峰，一級質(zhì)譜峰重疊在一起，且具有相同的質(zhì)荷比，無法根據(jù)它們一級譜圖對應峰的強度或者二級碎片譜圖的數(shù)量來定量分析。因此考察了它們混合二級圖譜中不同碎片的豐度。在二級質(zhì)譜圖上，二者的碎片離子b3、b5、y5、y7、y8、y9、y11、y12、y13的m/z 相差14，提取這幾對離子中豐度相對最高的3組碎片離子y8、y9、y11進行對比分析?？梢钥闯?Kme2SAPATGGVKmeKPHR 對應的離子y8、y9、y11和KmeSAPATGGVKme2KPHR 對應的y8*，y9*，y11*的相對豐度的比值分別為1.00、0.83和0.92(見表2)，平均比值是0.92。由此，我們可以分析這兩條多肽對兩個修飾位點的貢獻。

表2 肽段(aa 27-40)上不同修飾的最強離子豐度表Table 2 List of three most intense ions of distinct peptide species(aa 27-40)

3 結論

本文利用液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術結合蛋白質(zhì)信息學分析手段，考察了Hela 細胞組蛋白H3的翻譯后修飾。通過二級質(zhì)譜碎片解析，對質(zhì)荷比相同而修飾位點不同的肽段進行了圖譜解析，確定了多肽序列和修飾位點;利用二級碎片離子的豐度比，確定了修飾的豐度差異。對復雜樣品中多肽修飾的定性定量分析進行了探索性的研究。

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