二十二碳六烯酸聯(lián)合5-氟尿嘧啶對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

李群珍鄧紅何勁松伍茵張茂祥藍(lán)偉紅

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二十二碳六烯酸聯(lián)合5-氟尿嘧啶對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

李群珍1鄧紅2★何勁松1伍茵1張茂祥1藍(lán)偉紅1

目的研究二十二碳六烯酸（DHA）聯(lián)合5氟尿嘧啶（5-FU）對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2耐藥相關(guān)蛋白ERK、JNK及p38的表達(dá)。方法Western blot檢測(cè)5-FU 5μg/mL，或5-FU 5μg/mL聯(lián)合DHA 30 μg/mL作用HepG2細(xì)胞48 h后ERK、JNK及p38蛋白表達(dá)。結(jié)果與單用5-FU組比較，5-FU聯(lián)合DHA組對(duì)耐藥相關(guān)蛋白的影響，p-ERK明顯受到抑制，而p-JNK表達(dá)顯著增加，p-p38表達(dá)無(wú)差別。結(jié)論DHA對(duì)肝癌細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白的調(diào)控可能通過(guò)抑制ERK、激活JNK信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)5-FU的細(xì)胞毒活動(dòng)，發(fā)揮增敏化療藥物的作用。

二十二碳六烯酸；5-氟尿嘧啶；肝癌；多藥耐藥；絲裂原活化蛋白激酶

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是人體必需脂肪酸，主要從深海魚(yú)油中獲得[1]。近年來(lái)多項(xiàng)流行病學(xué)及基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，DHA不僅對(duì)多種惡性腫瘤具有抑制作用，而且能夠增強(qiáng)化療藥物5-氟尿嘧啶（5- fl uorouracil，5-FU）的療效[2]。但近年來(lái)，傳統(tǒng)化療藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用使癌細(xì)胞耐藥現(xiàn)象越來(lái)越普遍，這大大影響了化療藥物的臨床應(yīng)用。因此，研究腫瘤細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥機(jī)制、增加腫瘤細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性迫在眉睫。本研究以肝癌細(xì)胞株HepG2為主要對(duì)象,比較單用5-FU與5-FU聯(lián)合DHA對(duì)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 肝癌細(xì)胞株

肝癌細(xì)胞HepG2來(lái)源于ATCC，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，來(lái)源于一個(gè)15歲白人的肝癌組織。該細(xì)胞分泌多種血漿蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、鐵傳遞蛋白等。該細(xì)胞能大容量培養(yǎng)，乙肝表面抗原陰性，對(duì)G418有抗性，對(duì)人生長(zhǎng)激素有刺激反應(yīng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

HepG2細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞株，含青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）、0.3 g/L L-甘氨酸、0.85 g/L NaHCO3、10%小牛血清（56℃，滅活30 min）的DMEM完全培養(yǎng)液，在100%濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中，37℃單層貼壁生長(zhǎng)，待長(zhǎng)至80～90%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)，每2～3天換液一次，每5 天傳代一次，收集指數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

二十二碳六烯酸（cis-4，7，10，13，16，19-docosahexaenoic acid，SIGMA，USA）（St. Louis, MO），純度≥98%，融于無(wú)水酒精，濃度20 mg/mL，充滿(mǎn)氮?dú)夂?80℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

5-氟尿嘧啶（SIGMA，USA），融于二甲基亞砜DMSO（SIGMA，USA），濃度32 mg/mL，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

Western Blot檢測(cè)MAPK蛋白表達(dá)變化：提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，配制10%蛋白電泳分離膠和5%積層膠，蛋白變性上樣，上樣量30μg，按照積層膠電壓 70 V，分離膠電壓 100 V電泳，待溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠底部時(shí)停止電泳。恒壓20 V，30 min半干電轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉/TBS-T室溫封閉1 h，5%的脫脂奶粉/TBS-T 1:500稀釋相應(yīng)的一抗，與PVDF膜4℃孵育過(guò)夜，TBS-T洗滌，同樣方法1:3000稀釋HRP標(biāo)記二抗，室溫1 h，TBS-T洗滌后，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，Quantity one（Bio-Rad）軟件半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

各組藥物干預(yù)后對(duì)ERK、JNK及p38蛋白表達(dá)的影響：利用Western Blot檢測(cè)5-FU 5 μg/mL，或5-FU 5 μg/mL聯(lián)合DHA 30 μg/mL作用HepG2細(xì)胞48 h后ERK、JNK及p38蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，5-FU單獨(dú)處理組HepG2細(xì)胞的p-ERK表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），p-JNK表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而p-p38表達(dá)無(wú)變化（P＞0.05）。

5-FU聯(lián)合DHA組與單用5-FU組比較，聯(lián)合組p-ERK較單用5-FU組表達(dá)明顯受到抑制（P＜0.01），而p-JNK表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），p-p38表達(dá)無(wú)差別（P＞0.05）（見(jiàn)圖1和表1）。

3 討論

肝癌目前仍是我國(guó)發(fā)病率居前列的腫瘤，雖然肝癌綜合治療方面已做了大量研究并取得了一定的效果，但肝癌術(shù)后5年總生存率仍不夠理想?；熓侵委煾伟┍夭豢缮俚氖侄沃唬泻艽蟛糠只颊邔?duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥使得腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感。單藥治療效果不佳，多藥聯(lián)合化療可減少腫瘤的耐藥性，提高治療效果。

最近研究表明DHA不僅本身具有抗癌作用，DHA和某些藥物有協(xié)同作用，可增強(qiáng)抗癌藥物的細(xì)胞毒性，提升腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，減少抗癌藥物的副作用。腫瘤化療藥物耐藥性的存在，尤其是多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象，嚴(yán)重阻礙了化療藥物的應(yīng)用[3]。目前大多數(shù)研究都認(rèn)為，ERK的過(guò)度激活與多種化療藥物的耐藥性存在明顯正相關(guān)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控耐藥相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)[4]。Weldon等[5]通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)MCF7細(xì)胞株1 186個(gè)基因進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，MEK5（ERK5上游激酶）的過(guò)表達(dá)與耐藥株APOMCF7的耐藥性存在明顯的相關(guān)性。Kisucká等[6]發(fā)現(xiàn)，鼠白血病細(xì)胞系的耐藥株L1210/VCR（長(zhǎng)春新堿）多藥耐藥與ERK持續(xù)激活相關(guān)，其機(jī)制可能是ERK激活引起腫瘤細(xì)胞表面多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）基因表達(dá)量增加，P-gp可將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出，使細(xì)胞內(nèi)VCR濃度降低從而產(chǎn)生耐藥，而MEK特異性抑制劑PD98059和U0126可以抑制ERK活性，從而提高細(xì)胞內(nèi)VCR濃度并且逆轉(zhuǎn)L1210/VCR的耐藥性。

表1 ERK、JNK、p38在不同處理組細(xì)胞中的表達(dá)水平（相對(duì)于內(nèi)參GAPDH的條帶灰度值）Table 1 Expression level of JNK, ERK, and p38 in different groups（data of relative density compared with GAPDH）

圖1 5-FU單用或聯(lián)合DHA對(duì)HepG2細(xì)胞JNK、ERK及p38蛋白表達(dá)的影響Figure 1 Expression of JNK, ERK and p38 in HepG2 treated with 5-FU or 5-FU in combination with DHA for 48 hours

MDR癌細(xì)胞的存在是肝癌化療失敗的根本原因，因此，如何較滿(mǎn)意地解決肝癌細(xì)胞MDR問(wèn)題已成為當(dāng)務(wù)之急[7]。有資料表明，通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）系統(tǒng)的表達(dá)有可能逆轉(zhuǎn)MDR，成為腫瘤治療的新方法[8]。Chen等[9]發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞株MGC803預(yù)先用VCR處理72 h后，細(xì)胞內(nèi)P-gp表達(dá)量增加，對(duì)VCR的耐藥性提高了2.24倍，加入PD98059可以抑制P-gp表達(dá)，并且逆轉(zhuǎn)MGC803對(duì)VCR的耐藥性。但是，對(duì)于JNK和p38的激活程度在腫瘤化療藥物的作用目前還存在很多爭(zhēng)議。一些研究發(fā)現(xiàn)，JNK和p38激活程度與腫瘤化療的敏感性存在正相關(guān)。如Mansouri等[10]比較了卵巢癌順鉑（CDDP）敏感株2008以及耐藥株2008C13中MAPK激活情況，發(fā)現(xiàn)敏感株JNK和p38的激活程度明顯超過(guò)耐藥株。然而，另一些研究卻發(fā)現(xiàn)JNK和p38的持續(xù)激活與腫瘤細(xì)胞的耐藥性正相關(guān)[11]。

為了研究DHA是否可通過(guò)增強(qiáng)5-FU細(xì)胞毒性的調(diào)控機(jī)制，我們研究了DHA聯(lián)合5-FU對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響，Western Blot檢測(cè)證實(shí)DHA聯(lián)合5-FU較單獨(dú)使用5-FU組，ERK被抑制更加明顯，JNK被激活更加顯著，而p38活性沒(méi)有變化。這提示DHA可能通過(guò)抑制ERK或激活JNK活性，從而增強(qiáng)5-FU的細(xì)胞毒活性。

因此，在研究DHA聯(lián)合5-FU誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制時(shí)，采用Western Blot方法檢測(cè)5-FU單用或聯(lián)合DHA對(duì)HepG2細(xì)胞MAPK蛋白表達(dá)的變化，初步揭示DHA還可通過(guò)抑制ERK或激活JNK信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)5-FU的細(xì)胞毒活性。期望利用DHA通過(guò)不同通路協(xié)同化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)，同時(shí)可靶向耐藥位點(diǎn)達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥目的，拓展肝癌治療領(lǐng)域的研究，但是否能應(yīng)用于臨床尚需在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Effect of docosahexaenoic acid plus 5-fluorouracil on the drug-resistance associatedprotein of HepG2

LI Qunzhen1, DENG Hong2★, HE Jingsong1, WU Yin1, ZHANG Maoxiang1, LAN Weihong1
(1.Department of Nutrition, Second Hospital of Shenzhen, Guangdong, Shenzhen 518035, China; 2.Food and Nutrition Department, Public Health and Tropical Medicine of the Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China)

ObjectiveTo study the expression of drug-resistance associated protein, such as ERK, JUK and P38, in hepatocellular carcinoma HepG2 cells treated with docosahexaenoic acid and 5- fl uorouracil.MethodsThe expression of JNK, ERK and p38 were analyzed in HepG2 treated with 5-FU or 5-FU in combination with DHA for 48 hours by western blot.ResultsWhen compared with the group only treated with 5-FU, samples from the group treated with 5-FU and DHA showed different expression level of drugresistance associated-proteins. Down regulation of p-ERK, up regulation of p-JNK and no change of p-p38 could be found in the latter group.ConclusionWith inhibiting the p-ERK and activating p-JNK, DHA could regulate hepatocellular carcinoma cells to signi fi cantly enhance the cytotoxic activity of 5-FU. So that it could play a role in the sensitization of chemotherapy drugs.

Docosahexaenoic acid (DHA); 5- fl uorouracil (5-FU); Primary liver cancer; Multidrug resistance (MDR); Mitogen-activated protein kinase (MAPK)

1.廣東省深圳市第二人民醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，廣東，深圳 518035

2.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與衛(wèi)生學(xué)系，廣東，廣州 510515

★通訊作者：鄧紅，E-mail: hongd@ fi mmu.com