胡蘿卜MADS-box基因的克隆及表達分析

梁 毅，劉雪瑩,2，李景富，徐啟江，張洪偉

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京 100097；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；3.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，哈爾濱 150040）

MADS-box基因是一類廣泛存在于植物中的序列特異同源異型基因。由保守程度不同的MADS-box、I、K和C結(jié)構(gòu)組成[1]。通過對MADS-box基因家族的深入研究，在不同物種中克隆大量MADS-box基因，這些結(jié)果表明MADS-box基因在被子植物中的功能是保守的，大部分都參與花發(fā)育調(diào)控過程，并且在根、葉、胚珠及果實的發(fā)育中均起作用[2]。

近年來，植物花發(fā)育分子機制研究取得較大進展，其中雙子葉植物擬南芥、矮牽牛、金魚草的花同源異型突變體研究確定ABCDE模型[3-4]，初步揭開植物花發(fā)育的奧秘。該模型認為，A和E功能基因調(diào)控萼片發(fā)育，A、B和E功能基因調(diào)控花瓣發(fā)育，B、C和E功能基因調(diào)控雄蕊發(fā)育，C和E功能基因調(diào)控心皮發(fā)育，C、D和E功能基因調(diào)控胚珠發(fā)育，A和C功能基因相互拮抗。當(dāng)A基因發(fā)生突變時，C基因表達便會擴展，導(dǎo)致萼片異化為心皮，花瓣變?yōu)樾廴铮籅基因發(fā)生突變則會使花瓣變成萼片，雄蕊變成心皮；若C基因突變，則致使A基因表達擴展，雄蕊和心皮分別被花瓣和萼片代替。除APETALA2基因外，所有的花器官特征屬性基因均編碼MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，具有典型的MIKC結(jié)構(gòu)域模型[5-6]。研究表明，許多心皮型CMS系統(tǒng)中，B類MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的表達量都趨于下降[7-8]；根據(jù)ABCDE模型，若A基因被擴展到雄蕊，同時C基因被限制在心皮，則可產(chǎn)生雄蕊瓣化型的突變體[9]。

胡蘿卜（Daucus carrot），又稱甘荀，是傘形科野生胡蘿卜變種的一、二年生異花授粉草本植物，栽培歷史在2 000年以上。胡蘿卜花是復(fù)傘形花序頂生、花極小、白色或淡粉色[10]。胡蘿卜雄性不育的花有別與野生型而出現(xiàn)雄蕊瓣化現(xiàn)象，為進一步探究胡蘿卜花發(fā)育有關(guān)機制，采用RACE原理，克隆胡蘿卜相關(guān)MADS-box基因的全長cDNA，為胡蘿卜采用基因工程進行輔助育種提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

胡蘿卜品種由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心洋蔥與胡蘿卜課題組提供。采集花蕾及成花的各部分器官萼片、心皮、雄蕊，以及營養(yǎng)器官根、莖、葉。采集后用錫箔紙包裝后放入液氮中，存于-80℃冰箱中，用于總RNA提取。

1.2 cDNA的合成和cDNA全長的獲得

RNA提取采用TRIZOL試劑盒，具體步驟參見操作手冊。以RNA為模板，利用引物5'GACTCGA GTGCACATCGA（T）173'合成cDNA的第一條鏈。進行3'-RACE時，以第一鏈cDNA為模板，利用MADS-box基因簡并引物AD、SP3分別與P18E配對進行PCR擴增，擴增片段經(jīng)溶膠回收克隆到pGEM?-T載體（TaKaRa）。根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計引物GSP1、GSP2并進行巢式PCR，具體試驗步驟根據(jù)5'-full RACE kit（TaKaRa）試劑盒進行操作。獲得5'-序列后，將5'-與3'-序列進行拼接，從而獲得cDNA全長。試驗中使用的引物見表1。

1.3 胡蘿卜MADS-box基因表達RT-PCR分析

分別提取胡蘿卜的根、莖、葉、萼片、雄蕊、和心皮等器官的總RNA，選用cDNA合成試劑盒（TaKaRa），分別以各樣品總RNA為模板、Oligo（dt）20為引物合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板進行 RT-PCR?？傮w系為 25 μL，包括 2.5 μL 10×緩沖液（加Mg2+），2.0 μL dNTP上下游特異引物（2.0 mmoL·L-1）各0.8 μL，模板cDNA 1.0 μL，0.4 μL ExTaq酶（5 U·mL-1，TaKaRa），加滅菌蒸餾水至總體積25 μL。在反應(yīng)液上覆蓋一薄層液體石蠟油，保證PCR反應(yīng)時體系的穩(wěn)定性。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下進行檢測。使用肌動蛋白ACTIN作為內(nèi)參，試驗中使用的引物見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡蘿卜MADS-box基因序列的分析

將胡蘿卜花芽總RNA（見圖1A）反轉(zhuǎn)為cDNA，以cDNA第一條鏈為模板進行3'-RACE時PCR擴增產(chǎn)物的大小約為900 bp（見圖1B），5'-RACE的PCR擴增產(chǎn)物大小約為400 bp（見圖1C）。將上述兩片段拼接，獲得其全長cDNA序列。在NCBI上對該cDNA序列進行Blast分析，并將其推導(dǎo)的氨基酸序列與已知的MADS-box蛋白在DNAMAN中進行同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。經(jīng)上述分析可知，所得序列中有兩個序列具有MADS-box的保守區(qū)域和K區(qū)，其核苷酸序列分別與金魚草的DEFH49和擬南芥的AGL6同源性很高，故將兩個基因分別命名為DcSEP1和DcAGL6。

表1 試驗過程中涉及的引物Table 1 Primers used in the experiment

圖1 胡蘿卜花芽總RNA（A）、3'-RACE PCR產(chǎn)物（B）和5'-RACE PCR產(chǎn)物（C）電泳Fig.1 Electrophoresis of total RNA extracted from carrot flower bud(A),3'-RACE PCR products(B)and 5'-RACE PCR products（C）

DcSEP1（見圖2）的cDNA全長1 084 bp，3'-端非翻譯區(qū)為180 bp，poly（A）尾長19個腺苷酸，編碼區(qū)753 bp，對應(yīng)編碼251個氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)含有59個氨基酸的MADS區(qū)域，34個氨基酸的I區(qū)，65個氨基酸的K區(qū)，與擬南芥的SEPALLATA 3、杧果的SEPALLATA1-like、葡萄的SEPALLATA 1、矮牽牛的MADS-box同源性分別為60.23%、56.52%、70.24%和74.31%。

圖2 DcSEP1的核苷酸序列、推導(dǎo)的氨基酸序列及其與其他SEP-like蛋白的同源比對Fig.2 Nucleotide sequence and its deduced amino acid sequence of DcSEP1,and homologous comparison among DcSEP1 and other SEP-like proteins

DcAGL6（見圖3）的cDNA全長為1 061 bp，3'-端非翻譯區(qū)為273 bp，poly（A）尾長20個腺苷酸，編碼區(qū)747 bp，對應(yīng)編碼249個氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)含有57個氨基酸的MADS區(qū)、32個氨基酸的I區(qū)、77個氨基酸的K區(qū)。與擬南芥的AGL6、大麻槿的HcMADS、風(fēng)信子的HoMADS、矮牽牛的pMADS4同源性分別為58.98%、64.03%、59.36%和61.24%。

圖3 DcAGL6的核苷酸序列、推導(dǎo)的氨基酸序列及其與其他AGL6蛋白的同源比對Fig.Nucleotide sequence and its deduced amino acid sequence of DcAGL6,and homologous comparison among DcAGL6 and other AGL6 proteins

2.2 DcSEP1和DcAGL6的系統(tǒng)進化樹分析

為進一步弄清DcSEP1和DcAGL6的進化地位，在GenBank中獲得大量的SEP-like和AGL6基因，并以其推導(dǎo)的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。系統(tǒng)進化分析顯示克隆的兩個基因DcSEP1與SEP-like基因歸為同一分支，DcAGL6與AGL6基因聚為同一分支，均屬于E類基因（見圖4）。

2.3 基因特異性RT-PCR分析

為分析胡蘿卜花發(fā)育相關(guān)MADS-box基因在野生型花器官中的表達空間特異性，以胡蘿卜的根、莖、葉、萼片、雄蕊和心皮等器官的總RNA為模板，進行基因特異性RT-PCR檢測。

結(jié)果見圖5。

由圖5可知，克隆的兩個E類基因DcSEP1和DcAGL6都在營養(yǎng)器官根、莖、葉中無表達。在花器官萼片中也同樣未檢測到，而在心皮和雄蕊中都有微量表達。DcSEP1和DcAGL6在心皮的表達量均高于雄蕊。

圖4 DcSEP1和DcAGL6與其他同類蛋白的進化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed by DcSEP1,DcAGL6 and their homogeneous proteins

圖5 胡蘿卜MADS-box基因器官特異性表達分析Fig.5 Organ-specific expression analysis of carrot MADS-box genes

3 討論與結(jié)論

為了解MADS-box基因在調(diào)節(jié)花發(fā)育中的作用，利用RACE方法從胡蘿卜中克隆出兩個MADS-box基因DcSEP1和DcAGL6。將兩個基因與其他種類植物的MAD-box基因進行比較分析后結(jié)果顯示：DcSEP1與雙子葉植物矮牽牛的MADS12和金魚草的DEFH49的親緣性最高，而DcAGL6與雙子葉十字花科羽衣甘藍的BoAGL6和擬南芥的ATHAGL6的親緣性最高。由此可見胡蘿卜作為雙子葉植物的進化地位。DcSEP1和DcAGL6與其他物種類基因序列的相似性預(yù)示著它們具有相似功能。在過去的10年中，Martin Yanofsky及其同事一直在系統(tǒng)研究擬南芥MADS-box基因[11-12]。開始時，MADS-box基因均通過與AG的同源性來確定。因此，它們都被稱為AGAMOUS-LIKE（AGL）基因。近年來，他們發(fā)現(xiàn)三個序列高度同源且時空表達模式類似的MADS-box基因SEP1（原名AGL2）、SEP2（原名AGL4）和SEP3（AGL9）在花器官的形成中具有極其重要的作用。在花發(fā)育的早期和中期，SEP1和SEP2在所有四輪花器官中都表達[13]，這個研究結(jié)果與胡蘿卜所克隆的這兩個基因只在心皮與雄蕊中表達存在差異。SEP作為花器官同源異型基因ABCD的共因子（cofactor）在各輪花器官決定中發(fā)揮作用[14]。各進化系表達模式存在差異。加州嬰粟（Eschscholzia californica）中EScaAGL9在萼片原基起始后開始表達，主要集中在花瓣、雄蕊和心皮原基中，在花的發(fā)育過程中持續(xù)表達，該基因在發(fā)育的種子中有很高表達水平[15]。雖然E類基因的表達模式在被子植物不同物種中有差異，但該基因?qū)λ谢ㄆ鞴俚陌l(fā)育都是必需的，這一功能十分保守[6]。

本試驗克隆的DcSEP1和DcAGL6均屬于E類基因，通過序列分析和進化樹構(gòu)建進一步了解該類基因在不同物種中的表達，為胡蘿卜花器官研究奠定基礎(chǔ)。但有關(guān)其時空表達模式和功能，有待于利用Northern雜交和基因敲除等方法進行深入研究。

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