大豆耐鹽性鑒定體系的建立

柏 錫，吳芳芳，林凡敏，趙曉雯，狄少康，朱延明，李 勇，才 華，紀 巍

（東北農業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

目前，我國鹽土面積約2 800萬hm2，全國有600萬hm2次生鹽漬化面積且逐年增加[1]。我國耕地面積急劇減少，鹽堿地的利用對解決糧食問題具有巨大潛力。鹽堿地的開發(fā)利用有多種途徑，培育和種植耐鹽作物品種是經濟有效的方法之一。

大豆是重要的糧食作物、油料作物和工業(yè)原料，是中度耐鹽植物，受鹽漬條件影響顯著[2]，在鹽漬條件下產量下降明顯，而鹽敏感品種較耐鹽品種受鹽脅迫影響大。提高大豆的耐鹽性方法很多，通過植物基因工程技術培育耐鹽大豆新品種，是當前國際上的熱門研究課題。建立便捷、穩(wěn)定的大豆耐鹽性鑒定體系，是耐鹽大豆種植推廣和轉基因大豆高效篩選的必要前提。本研究采用沙土水溶液的培養(yǎng)方法，選取本實驗室轉基因育種中3個主要受體品種綏農28、合豐50和合豐55為材料，分別在種子發(fā)芽期（VE期）、第二片三出復葉長出時期（V2期）進行不同濃度NaCl處理，測定多項生理指標，建立3個大豆品種的耐鹽轉基因大豆篩選體系。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇東北地區(qū)主栽大豆品種綏農28（SN28）、合豐50（HF50）和合豐55（HF55）為材料，由黑龍江省農業(yè)科學院提供。

1.2 方法

1.2.1 VE期大豆發(fā)芽率的測定

精選籽粒飽滿、種皮完整、大小均勻的種子，采用氯氣滅菌的方法[4]，滅菌12～14 h，將滅菌的種子擺放在經高溫消毒（180℃×2 h）后的砂床里，該沙床以12 cm×2 cm的培養(yǎng)皿為容器，內為20目的石英砂。用滅過菌的NaCl溶液進行鹽脅迫處理，NaCl處理濃度分別為0、100、150、200、250 mmol·L－1，每個處理使用30粒大豆，并重復3次。于（25±1）℃、光周期18 h/6 h的光照培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽試驗。處理后第7天測定發(fā)芽率。

1.2.2 V2期耐鹽性的測定

種子用5%NaClO溶液消毒2～3 min，用自來水沖洗后再用蒸餾水浸泡4～5 h[4]，待種子充分吸水膨脹后，將其播種于盛有砂性土（細沙∶草炭土=7∶3）的育苗盤中。培養(yǎng)時將育苗盤放入盛有20 L蒸餾水的20 cm×80 cm白缽中，并保持砂性土2/3高度處于水面下。每天向白缽中補入一定量的蒸餾水，以維持水面高度。待幼苗長至V2期，將白缽中的蒸餾水換成不同濃度的NaCl溶液。NaCl處理濃度分別為 0、100、150、200 mmol·L－1，電導率分別維持在800 μs·cm－1、11～12、15～16、20～21 ms·cm－1。每個處理含30粒大豆種子，并重復3次。處理時間約為5～8 d。

1.3 各項生理指標的測定方法

1.3.1 種子發(fā)芽率

發(fā)芽標準為胚根伸出種臍部分長度超過種子縱徑一半為標準，要求胚根發(fā)育正常，但胚根彎曲并呈螺旋狀盤繞者不予統(tǒng)計。

1.3.2 死亡葉面積率

死亡葉面積率（%）=死亡葉片個數(shù)/總葉片數(shù)×100%。

統(tǒng)計時以干枯部分占葉片面積的比例來計算（例如只有一半葉片干枯即為1/2個葉片）。

1.3.3 相對株高鹽害率

相對株高鹽害率（%）=（對照植株平均株高－處理后植株的平均株高）/對照植株平均株高×100%；

株高為幼苗莖與沙土接觸面到最新的生長點之間的距離。

1.3.4 相對電導率

取植株第一片三出復葉，保證樣品的一致性。用打孔器打9個葉盤浸入20 mL ddH2O中，10 h后用DDS－11A型電導率儀測定電導率，記為R1。沸水浴上加熱30 min，冷卻后測定電導率，記為R2。相對電導率（%）=R1/R2×100%。

1.3.5 丙二醛含量

稱取植物材料0.5～1 g放入研缽中，加入液氮研磨至粉末，加入4 mL 5%TCA，5 000 r·min－1離心10 min。吸取離心的上清液2 mL（對照加2 mL蒸餾水），加入2 mL 0.6%TBA溶液，搖勻。將離心管放入沸水浴中煮沸10 min（自試管內溶液中出現(xiàn)小氣泡開始計時），取出試管并冷卻，3 000 r·min－1離心15 min，以0.6%TBA 溶液為空白對照測定在532、600和450 nm波長下的吸光度值。

MDA濃度（μmol·L－1）=6.45 ×（D532－D600）－0.56×D450。

MDA 含量（μmol·g－1）=MDA濃度（μmol·L－1）×提取液體積（mL）×10－3/樣品重量（g）。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NaCl對種子發(fā)芽率的影響

鹽分可從如下兩個方面影響種子的發(fā)芽率：一是建立滲透勢阻止水分吸收，二是離子毒害。鹽分脅迫降低種子儲藏物質分解和轉化速率，也造成活性氧產生和清除系統(tǒng)動態(tài)平衡的破壞，啟動膜脂過氧化或脫脂作用，損傷膜脂和膜蛋白，從而抑制種子發(fā)芽。不同濃度NaCl處理下大豆的發(fā)芽率見圖1、2（圖1彩版見封三）。隨著NaCl濃度的增高，3個品種種子發(fā)芽率均在逐漸減小，說明該方法能夠保證處理條件的穩(wěn)定，從而準確地區(qū)分不同濃度NaCl對大豆的傷害。綏農28、合豐55和合豐50這3個品種分別在150、200和150 mmol·L－1的NaCl濃度下50%的種子發(fā)芽率被抑制。在相同NaCl濃度處理下，3個品種表現(xiàn)出不同的種子發(fā)芽能力：合豐55＞綏農28＞合豐50。這說明種子發(fā)芽率可以作為這3個品種耐鹽性的一個篩選標準。

圖1 不同濃度NaCl對大豆發(fā)芽的影響Fig.1 Effect of different concertration NaCl on germination of soybean

圖2 鹽脅迫下種子發(fā)芽率的變化Fig.2 Change of germination rate of soybean under salt stress

2.2 不同濃度NaCl對死亡葉面積率的影響

葉片對生境條件的反應最為敏感。鹽脅迫開始時造成植物葉片失綠、葉片生長速率降低，隨著鹽害的增強，葉片停止生長，葉面積不再增加，葉尖葉緣焦黃，葉柄變軟并逐漸死亡[10]。所以，死亡葉面積率是衡量鹽害程度的一個重要指標。

本研究觀察了3個大豆品種在不同NaCl濃度下的死亡葉面積率（見圖3，此圖彩版見封三），并進行統(tǒng)計分析，從顯著性分析中可以看出，合豐50、合豐55、綏農28分別在200、150、100 mmol·L－1的NaCl處理下死亡葉面積率與對照之間存在顯著性差異，因此，選擇這3個濃度為大量轉基因大豆進行耐鹽性分析時所取的處理濃度。通過統(tǒng)計分析，在最大處理濃度200 mmol·L－1NaCl條件下，3個品種死亡葉面積率表現(xiàn)為合豐55＞合豐50＞綏農28，死亡葉面積率可作為大豆耐鹽性的一個篩選標準。

2.3 不同濃度NaCl對相對株高的影響

過量鹽分對植物造成滲透脅迫，從而干擾營養(yǎng)離子平衡，鹽分通過抑制和誘導多種酶系統(tǒng)來影響植物的正常生長[11]。生物量是植物對鹽脅迫反應的綜合體現(xiàn)，也是植物耐鹽性的直接指標之一。

不同濃度NaCl下的相對株高鹽害率見圖4?？梢钥闯鲭S著NaCl濃度的增高，大豆株高受到的抑制越嚴重。在4個處理濃度下，合豐55相對株高減小幅度最大，其次是綏農28，最小的是合豐50。該結果同樣顯示出合豐55耐鹽能力最差。相對株高可以作為大豆耐鹽性的一個篩選標準。

圖3 不同濃度NaCl對大豆苗期死亡葉面積率的影響Fig.3 Effect of different NaCl concentrations on soybean leaf mortality

圖4 鹽脅迫下相對株高的變化Fig.4 Change of relative height under salt stress

2.4 不同濃度NaCl對相對電導率的影響

在植物抗逆研究中，細胞膜透性變化已成為一個公認的指標。一般認為耐鹽能力強的品種在鹽脅迫下，細胞膜透性變化較小，敏感品種則變化較大[12]。Mckay指出可以用相對電導率來表示細胞膜透性的大小，它可以反映植物細胞膜在各種逆境條件下的細胞膜受損程度[3]。

圖5 鹽脅迫下相對電導率的變化Fig.5 Change of relative electricity conductivity under salt stress

圖5列出了不同濃度NaCl處理下的相對電導率，可以看出隨著NaCl濃度的增高，葉片相對電導率不斷增大。統(tǒng)計分析表明在各個品種中各處理和對照之間都存在著顯著差異。結果顯示在鹽脅迫下合豐55質膜受到的損害最大，其次是合豐50，最小的是綏農28。該結果與死亡葉面積率的分析結果一致。相對電導率可以作為大豆耐鹽性的一個篩選指標。

2.5 不同濃度NaCl對丙二醛含量的影響

由圖6可知，隨著NaCl濃度的增高，丙二醛含量也在增高，說明受到的鹽害程度在增大?？傮w上3個品種間受傷害的程度為：合豐55＞合豐50＞綏農28。合豐50、合豐55、綏農28分別在200、150、100 mmol·L－1NaCl處理下的丙二醛含量將作為這3個品種耐鹽性的一個篩選標準。該結果也與死亡葉面積率等結果一致，同時，從圖中可以看出在4個處理濃度下3個品種的變化趨勢完全一致。因此，丙二醛含量將作為耐鹽性分析的一個理想指標。

圖6 鹽脅迫下丙二醛含量的變化Fig.6 Change of MDA content under salt stress

2.6 耐鹽轉基因大豆的篩選

本研究應用該耐鹽性鑒定體系，對已經獲得的轉耐鹽基因GsGST14的合豐55的大豆進行耐鹽性分析，通過表型試驗和生理指標的測定，發(fā)現(xiàn)轉基因大豆比野生型大豆具有顯著的耐鹽能力。結果見圖7。

從圖7中可以看出，受到鹽脅迫后，與野生型（合豐55）相比轉基因植株的相對電導率和丙二醛含量明顯較低，說明轉基因大豆植株受到的傷害遠遠小于非轉基因大豆；特別是表型數(shù)據相對株高的比較，可以看出，鹽脅迫對轉基因大豆株高的影響微乎其微，而非轉基因大豆株高受到的影響是轉基因大豆的幾十倍，嚴重妨害大豆的正常生長和產量。以上結果表明，本文的鑒定體系非常適合于大豆耐鹽性鑒定和轉基因大豆的篩選。

圖7 轉基因大豆耐鹽性分析Fig.7 Analysis of salt tolerance in transgenic soybean under salt stress

3 討 論

鹽漬土壤是陸地上分布廣泛的一種土壤類型，選育具有較高耐鹽能力的大豆，對增加糧油需求，改善土壤結構和有機質含量，緩解土壤鹽漬化危害具有重要意義。大豆在各個生長階段對鹽脅迫的敏感程度不同，因此，對大豆各生長階段進行耐鹽性分析尤為必要。在大豆發(fā)芽期，本研究采用砂培法，整個培養(yǎng)過程中始終使種子處于無菌狀態(tài)，解決了以往砂培法培養(yǎng)過程中長菌以及用土壤培養(yǎng)法對鹽脅迫的緩沖作用。在本研究中采取沙土水溶液法對大豆苗期的耐鹽性進行分析，該方法采用疏松的沙土作為營養(yǎng)供給物，用水來傳輸營養(yǎng)物質并維持不同植株處于相同的生長條件下，在培養(yǎng)過程中通過維持水位一致和電導率一致來保證培養(yǎng)條件的一致性，解決傳統(tǒng)水培法需要頻繁配制和更換營養(yǎng)液、易長霉菌、植株徒長和工作量大、土培法無法保證土壤環(huán)境均一、試驗結果重復性較差等問題。

本文采用改良砂培法和沙土水溶液法（結合砂培法和水培法并改進）分別對大豆發(fā)芽期與幼苗期的耐鹽性分析，結果表明，該方法能有效區(qū)分不同品種、不同鹽濃度下植株受鹽害程度，多個性狀和生理指標間具有一致性，說明該方法適合于對大豆進行耐鹽性鑒定。隨著植物生物技術發(fā)展，轉基因育種已成為一種快速、有效的手段培育耐逆品種，對這些耐逆轉基因品種進行耐逆性分析，是進行推廣的前提條件。在本研究中，通過大豆苗期耐鹽性分析方法對前期獲得的轉基因大豆進行耐鹽性分析，發(fā)現(xiàn)該方法能明顯區(qū)分轉基因大豆和野生型的耐鹽能力，進一步證明該方法的可行性。

4 結論

本研究建立大豆耐鹽性鑒定體系，其中包括大豆種子發(fā)芽期和幼苗期。兩個階段分別采用改良的砂培法、沙土水溶液法，大豆發(fā)芽期選取抑制50%大豆萌發(fā)的濃度作為評價大豆種子萌發(fā)期耐鹽性的指標；大豆幼苗期選取死亡葉面積率、相對株高作為形態(tài)指標；相對電導率、丙二醛含量作為生理指標；經證明兩個方法簡單、有效、一致。

[1]孫建昌,王興盛,楊生龍.植物耐鹽性研究進展[J].干旱地區(qū)農業(yè)研究,2008,26(1):226－230.

[2]郭寶生,翁躍進.大豆耐鹽機理及相關基因分子標記[J].植物學通報,2004,21(1):113－120.

[3]Le J D,Dunn S D,Shannon G.Evaluation of a simple method to screen soybean genotypes for salt tolerance[J].Crop Science,2008,48:2194－2200.

[4]劉海坤,衛(wèi)志明.一種大豆成熟種子的消毒方法[J].植物生理學通訊,2002,38(3):261－263.

[5]Na G Q,He K,Cao M J.Salt and slkaline tolerance evaluation of different soybean varieties at germination stage[J].Soybean Science,2009,28:332－346.

[6]Qi D L,Zhang S Y,Cao G L.Studies on screening methods for alkaline tolerance at germination period and early seedling stage in rice[J].Journal of Plant GenetiResources,2006,7(1):74－80.

[7]Sun X F,Zheng Q S,Liu Y L.Salinity injury to germination and growth of cotton(Gossypium hirsutum L.)at emergence and seedling stages[J].Journal of Lant Resources and Evironment,2000,9(3):22－25.

[8]Patterson B D,Macrea E A,Ferguson I B.Estimation of hydrogen peroxide in plant extracts titanium[J].Analytical Biochemistry,1984,139:487－492.

[9]Zhang J,Jiang C D,Ping J C.Research advances about the effect of salt stress on photosynthesis of plant[J].Journal of Agricultural Sciences,2008,19(3):74－79.

[10]Luo Q Y,Yu B J,Liu Y L.Effect of NaCl on the growth,K+,Na+and Cl－distribution in seedlings of 6 soybean cultivars(Glycine max L.Merrill)[J].Soybean Science,2001,20(3):177－182.

[11]王東明,賈媛,崔繼哲.鹽脅迫對植物的影響及植物鹽適應性研究進展[J].中國農學通報,2009,25(4):124－128.

[12]彭斌.大麥耐鹽性研究進展[J].大麥科學,2003(1):26－29.

[13]Mckay H M,Mason W L.Physiologically indicators of tolerance to cold storage in sitka spruce and douglas－fir seedings[J].Canadian Journal Forest Research,1991(21):890－901.

[14]張玉霞,李志剛,李美娟,等.四種草地早熟禾抗鹽堿生理生化特性的研究[J].中國農學通報,2004(10):209－213.