菲律賓蛤仔3種殼色群體低鹽耐受能力的比較研究

丁鑒鋒,王銳,閆喜武,趙立強,楊鳳,王連順

(大連海洋大學水產與生命學院遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心,遼寧大連116023)

菲律賓蛤仔3種殼色群體低鹽耐受能力的比較研究

丁鑒鋒,王銳,閆喜武,趙立強,楊鳳,王連順

(大連海洋大學水產與生命學院遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心,遼寧大連116023)

通過測定3種殼色群體菲律賓蛤仔Ruditapesp hilippenarum(斑馬蛤、珍珠白和對照組)在低鹽度(15)海水中0、1.5、3、6、12、24、48 h時的死亡率、個體平均增重、血漿滲透壓、Na+濃度、Cl-濃度、血漿總蛋白濃度、鰓組織三磷酸腺苷(ATP)酶活性及血細胞總數等指標,比較了3種殼色菲律賓蛤仔的低鹽耐受能力。結果表明:斑馬蛤的死亡率最低 (3.92%);3種殼色蛤仔的血漿滲透壓均呈現逐漸降低的趨勢,第24 h時,斑馬蛤滲透壓顯著高于對照組(P＜0.05),第48 h時,3種殼色蛤仔的血漿滲透壓都與海水滲透壓接近;3種殼色蛤仔血淋巴中Na+濃度均呈現升高過程,第24 h時,珍珠白和斑馬蛤的Na+濃度達到最大值,顯著高于對照組(P＜0.05);對照組蛤仔Cl-濃度呈現先升高后恢復的過程,而斑馬蛤和珍珠白Cl-濃度呈現先降低后恢復的過程,第24 h時,斑馬蛤和珍珠白血淋巴Cl-濃度顯著高于對照組(P＜0.05); 3種殼色蛤仔的ATP酶活性呈現先升高后恢復的過程,第6 h和24 h時,珍珠白鰓組織ATP酶活性顯著高于對照組(P＜0.05);3種殼色蛤仔的血細胞總數也呈現先升高后恢復的過程,第1.5 h時,珍珠白和斑馬蛤血細胞總數顯著低于對照組(P＜0.05),第48 h時,斑馬蛤血細胞總數顯著高于對照組(P＜0.05)。

菲律賓蛤仔;殼色;低鹽脅迫;滲透壓;ATP酶活性

菲律賓蛤仔Ruditapesp hilippenarum隸屬于雙殼綱、簾蛤科、綴錦亞科、蛤仔屬,是一種廣溫、廣鹽性海水養(yǎng)殖貝類,中國年產菲律賓蛤仔300萬t左右,約占中國貝類產量的30%,占海水養(yǎng)殖總產量的20%,占世界菲律賓蛤仔總產量的90% 以上[1]。但目前蛤仔養(yǎng)殖中存在種質資源性狀退化、品質下降等問題,而雜交育種是解決這些問題的一條有效途徑。在貝類生長過程中,由于受自然條件和生理因素等影響,不同群體之間或同一群體中產生了殼色多態(tài)性。對馬氏珠母貝 Pinctada fucata martensi[2]、海灣扇貝 Argopecten irradians[3]、蝦夷扇貝Patinopecten yessoensis[4]和菲律賓蛤仔[5]的研究發(fā)現,這些海產經濟貝類不同殼色個體的生長速度、成活率、免疫能力等指標差異顯著,尤其重要的是多種貝類的殼色能夠穩(wěn)定遺傳。因此,將殼色作為一個表型標記,應用于苗種培育具有廣闊的應用前景。閆喜武等[6-8]對菲律賓蛤仔的研究發(fā)現,不同殼色群體蛤仔的生長速度、存活率等性狀和表型存在顯著差異。菲律賓蛤仔主要在潮間帶分布,夏季大雨經常會導致其生存環(huán)境的鹽度迅速降低,研究證實,鹽度降低會影響蛤仔的免疫能力,與蛤仔疾病的爆發(fā)具有一定關聯[9]。本研究中,作者對不同殼色群體蛤仔的低鹽耐受能力進行了比較研究,旨在進一步探討蛤仔殼色與鹽度的關系,為其種質改良提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用菲律賓蛤仔采自莊河海區(qū),選取體質量為 (11.34±0.81)g、殼長為 (39.85±0.81)mm、具有鮮明殼色特征的健康菲律賓蛤仔個體為研究對象。試驗分為3組,每組150只,其中斑馬蛤群體,殼面具有斑馬條狀花紋;珍珠白群體,背景顏色為白色,左殼背部有一條深色放射條帶;對照組,隨機選取各種殼色個體組成。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 將蛤仔置于水槽中暫養(yǎng),暫養(yǎng)期間海水鹽度為32,水溫為 (22±1)℃,連續(xù)充氣,每天更換海水1次,投喂螺旋藻粉1次。暫養(yǎng)7 d后,將蛤仔置于鹽度為15的海水中,在第0、1.5、3、6、12、24、48 h時從每組隨機抽取10枚樣品進行試驗處理,并記錄死亡數。

1.2.2 個體增重的測定 分別選取各種殼色的個體30枚,稱重后置于網袋中,放入鹽度為15的海水中,在試驗的第 0、1.5、3、6、12、24、48 h時取出,擦干表面后稱重。

1.2.3 血淋巴細胞樣品的制備 在試驗的各時間點,從各組分別取10枚個體,使用1 mL無菌注射器從蛤仔圍心腔中抽取血淋巴400 μL,加入到1.5 mL的樣品管中并置于冰上。將每2枚蛤仔的樣品混合后進行后續(xù)試驗測定。

1.2.4 鰓組織上清液的制備 用無菌剪刀剪取蛤仔鰓組織,稱重后加入10倍質量的冷卻蒸餾水制成質量分數為10%的勻漿,取100 μL該勻漿,加入900 μL的生理鹽水制成體積分數為10%的組織勻漿,用于三磷酸腺苷 (ATP)酶活性的檢測。

1.2.5 血細胞總數的測定 取30 μL血淋巴樣品加入到等量的 BFC固定液 (NaCl 2%,乙酸鈣1%,甲醛4%,均為體積分數)中,混勻后吸取10 μL加到血球計數板上,在10倍光鏡下觀察并計數。

1.2.6 血漿蛋白濃度和血淋巴滲透壓的測定 使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒 (購于碧云天生物技術研究所)測定蛤仔血漿蛋白濃度,以小牛血清白蛋白作為標準蛋白。

取血淋巴樣品50 μL,使用OSMOMAT?030滲透壓儀 (Gonotec德國)測定血漿滲透壓。

1.2.7 氯離子 (Cl-)和鈉離子 (Na+)濃度的測定 分別使用氯化物測定試劑盒和Na+測定試劑盒(均為南京建成科技有限公司)測定血淋巴中Cl-和Na+的濃度,其計算公式為

其中:A樣為樣品的吸光度值;A標為標準品的吸光度值;C標為標準品中Cl-(Na+)的濃度(mmol/L)。1.2.8 ATP酶活性的測定 使用超微量ATP酶測試盒 (南京建成科技有限公司)測定鰓組織中ATP酶的活性。測定時使用上述制成的鰓組織上清液。酶活性定義:每小時每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產生1 μmol無機磷的量為一個ATP酶活力單位。

1.3 數據處理

試驗結果均用平均值±標準差 (mean±S.D.)表示,使用SPSS 11.5軟件進行單因素方差分析,顯著性水平設為0.05。

2 結果

2.1 3種殼色蛤仔死亡率和個體平均增重的比較

3種殼色蛤仔放入鹽度為15的海水中48 h后,對照組死亡率最高 (18.18%),其次為珍珠白蛤仔 (8.08%),斑馬蛤死亡率最低 (3.92%)。

從圖1可見:將蛤仔放入低鹽海水后,3種殼色蛤仔個體質量都表現出先增加后恢復的過程,其中對照組在第12 h時個體平均增重顯著高于斑馬蛤和珍珠白個體 (P＜0.05)。

圖1 3種殼色蛤仔個體平均增重的比較Fig.1 Comparison of body weight gain in the clams with three shell colors

2.2 3種殼色蛤仔血漿滲透壓變化的比較

從圖2可見:3種殼色蛤仔血淋巴滲透壓都表現出逐漸降低的趨勢,第0、1.5、3、6、12 h時,珍珠白、斑馬蛤血淋巴滲透壓與對照組蛤仔無顯著性差異 (P＞0.05);第24 h時,斑馬蛤血淋巴滲透壓顯著高于對照組 (P＜0.05);第48 h時,斑馬蛤血淋巴滲透壓 (0.474 mOsm/mg)與海水(0.465 mOsm/mg)接近,而對照組蛤仔血淋巴滲透壓 (0.549 mOsm/mg)和珍珠白蛤仔血淋巴滲透壓 (0.602 mOsm/mg)略高于海水滲透壓,但各組間無顯著性差異 (P＞0.05)。

2.3 3種殼色蛤仔血漿Na+和Cl-濃度的比較

從圖2可見:第0、1.5、3、6、12 h時,各組蛤仔血淋巴Na+濃度變化較小,各組間無顯著性差異 (P＞0.05);之后各組都出現一個升高過程,第24 h時,珍珠白和斑馬蛤血淋巴Na+濃度顯著高于對照組 (P＜0.05)。

從圖2可見:對照組蛤仔血淋巴Cl-濃度呈先升高后降低的趨勢,第3 h和第24 h時分別出現一個最高值和最低值;斑馬蛤和珍珠白血淋巴Cl-濃度呈先降低后升高的趨勢,斑馬蛤在第6 h和第12 h時、珍珠白在第1.5 h和第24 h時分別出現一個最低值和最高值;第24 h時,斑馬蛤和珍珠白血淋巴Cl-濃度均顯著高于對照組 (P＜0.05)。

2.4 蛤仔血漿蛋白和鰓組織ATP酶活性的比較

從圖2可見:3種殼色蛤仔血漿蛋白濃度呈先升高后降低的趨勢;第6 h時,珍珠白蛤仔血漿蛋白濃度顯著高于斑馬蛤 (P＜0.05);第48 h時,斑馬蛤血漿蛋白濃度顯著高于珍珠白 (P＜0.05),其余時間點各組間均無顯著性差異 (P＞0.05)。

從圖2可見:3種殼色蛤仔鰓組織ATP酶活性都呈先升高后降低的趨勢;第1.5、6、24 h時,珍珠白鰓組織ATP酶活性顯著高于斑馬蛤 (P＜0.05);第6 h和第24 h時,珍珠白鰓組織ATP酶活性顯著高于對照組 (P＜0.05),其余時間點各組間均無顯著性差異 (P＞0.05)。

2.5 3種殼色蛤仔血細胞總數變化的比較

從圖2可見:3種殼色蛤仔血細胞總數都呈先升高后降低的趨勢;第1.5 h時,珍珠白和斑馬蛤血細胞總數顯著低于對照組 (P＜0.05);第6 h時,珍珠白血細胞總數顯著高于斑馬蛤 (P＜0.05);第12 h時,斑馬蛤血細胞總數顯著低于對照組 (P＜0.05);而第48 h時,斑馬蛤血細胞總數顯著高于對照組 (P＜0.05)。

圖2 3種殼色群體蛤仔血漿滲透壓、Na+濃度、Cl-濃度、血淋巴蛋白濃度、ATP酶活性和血細胞總數變化的比較Fig.2 Comparative changes in osmotic pressure,sodium and chloride ion concentrations,plasma protein concentra tions,ATPase activity and total hemocyte count in the clam with three shell colors

3 討論

貝類殼色是可以遺傳的,殼色及色素沉積模式由簡單的孟德爾遺傳基礎控制,環(huán)境因素尤其是生長環(huán)境的鹽度和溫度對殼色選擇有重要影響,是不同群體之間或同一群體中產生殼色多態(tài)性的重要原因之一[10]。如泥螺 Batillaria attramentaria殼色的多態(tài)性與潮汐和環(huán)境溫度變化有關[11],而對灘棲螺Littorina obtusata和Littorina saxatilis的相關研究也表明,水環(huán)境溫度和鹽度對殼色顯型的選擇均具有較高的貢獻[12-14]。貝類殼色是自然選擇的結果,具有適應意義的性狀在進化中才會被保留下來,因此,貝類的殼色與其鹽度耐受能力之間可能具有某種相關性。

貝類主要通過其頭部的觸角、外套膜邊緣和出水管表面上的兩種感受器 (滲透壓感受器和離子感受器)感受外界環(huán)境滲透壓和離子濃度的變化。當外界環(huán)境鹽度短時間降低時,貝類可以通過關閉貝殼,使機體與低鹽環(huán)境隔離,減小低鹽對自身的傷害。因此,貝殼的密閉性能夠維持短期內其對鹽度變化的耐受能力。Bauchau[15]的假說認為:貝類生長受神經調控,貝殼色素作為一種穩(wěn)定的信號標記能夠被神經末梢識別,并且神經系統(tǒng)對不同色素的識別能力不同,色素分布形狀能夠調節(jié)貝殼生長過程以獲得最佳的結構 (如雙殼類貝殼的對稱性),而對稱性良好的貝殼具有更好的密閉性,因此,殼色花紋可能會通過調節(jié)貝殼的對稱性而對其低滲耐受能力產生影響。當低滲溶液進入到貝類體內后,一部分會進入細胞而使細胞體積增大,導致體質量增加[16]。本研究結果表明,將蛤仔轉入低鹽海水后,對照組體質量增加最多,其他兩個殼色的個體增重不明顯,同時對照組的死亡率最高,珍珠白殼色居中,斑馬蛤最低,表明3種殼色蛤仔對低鹽耐受能力不同,可能與殼色花紋有一定關系。

本研究中,在鹽度為15的海水環(huán)境中,蛤仔血淋巴滲透壓逐漸降低,48 h后斑馬蛤滲透壓與海水幾乎相同,而對照組和珍珠白略高于海水,這與對貽貝 Mytilus edulis[17]和雜色鮑Haliotis diversicolor supertexta[18]的相關研究結果相一致。研究表明:當環(huán)境滲透壓發(fā)生變化時,貝類體內的Na+和Cl-在滲透壓調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用,鹽度降低時這些離子的通道被激活,離子從細胞內泵出,通過降低細胞內的離子濃度來保持細胞內外滲透壓平衡[19]。本研究中,僅對照組血淋巴中Cl-濃度在3 h時出現一個短暫升高,隨后恢復到原來的水平,其他兩種殼色血淋巴中Cl-濃度在試驗期內均未出現顯著變化,而對照組的結果與Cheng等[18]在鮑中觀察到的結果一致。3種殼色蛤仔血淋巴中Na+濃度在試驗前期未出現較大波動,但對照組在第48 h時、兩個試驗組在第24 h時達到最大濃度, Na+濃度升高可能是細胞內Na+被轉移到細胞外的結果。Cheng等[18]研究發(fā)現:鮑血淋巴中 Cl-和Na+對滲透壓的貢獻率分別為37.1% ～42.2% 和47.7%～51.6%。本研究中滲透壓降低沒有伴隨離子濃度的降低,其原因可能有以下兩個方面:1)蛤仔屬于雙殼貝類,在低鹽環(huán)境中可以形成封閉空間,而鮑無法形成類似空間,因此,二者在滲透壓調節(jié)方式上有所區(qū)別;2)貝類血淋巴中的蛋白質和游離脂肪酸如?；撬岬仍谪愵惗唐跐B透壓調節(jié)中發(fā)揮了重要作用[20]。本研究中3種殼色蛤仔鰓組織ATP酶在試驗初期都表現出升高趨勢,表明蛤仔體內離子調節(jié)的途徑可能發(fā)揮了作用。

研究發(fā)現,貝類在短期內能夠通過提高細胞內蛋白質和RNA的合成速度以適應滲透壓變化,其原因主要是低鹽脅迫導致貝類體內一些參與調節(jié)滲透壓的酶類被誘導表達,不過在較長時間的適應過程后 (幾天或幾周后)其合成速度會逐漸恢復正常[21]。這與本研究的結果相一致,對照組血漿蛋白在第3 h和第24 h時分別出現一個升高的過程,其他兩種殼色在第24 h時達到最大值,隨后都逐漸恢復到正常值。

本研究中,觀察到鹽度降低導致各種殼色蛤仔血細胞總數增多的現象,對照組在第1.5 h和24 h時、斑馬蛤在第3 h和48 h時、珍珠白蛤在第6 h和24 h時分別達到一個峰值,這一結果與Matozzo等[9]對簾蛤Chamelea gallina的研究結果一致。鹽度降低能夠促使大量血細胞從組織進入血淋巴,以增強個體在環(huán)境脅迫下的防御能力,是動物對環(huán)境變化的一種適應性反應。

相關生理指標的測定結果表明,3種殼色的蛤仔對短期低鹽脅迫的適應過程并未表現出顯著的差異,但對照組在低鹽條件下表現出最高的死亡率,而斑馬蛤死亡率最低,其原因可能是由于貝類的密閉性不同所致,而殼密閉性主要與其對稱性有關,殼對稱性又與殼色花紋有關。因此,個體的低鹽耐受能力可能與殼色有一定的相關性,不過,由于本試驗僅使用1個低鹽條件,選用的殼色群體相對較少,試驗時間也相對較短,這一結論有待進一步研究證實。

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Comparative tolerance to low salinity stress in Manila clam Ruditapes philippinarum with three shell colors

DING Jian-feng,WANG Rui,YAN Xi-wu,ZHAO Li-qiang,YANG Feng,WANG Lian-shun

(Engineering Research Center of Shellfish Culture and Breeding in Liaoning Province,College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

The mortality rate,average body weight increment,the osmotic pressure,ATPase activity,total haemocyte count(THC),and sodium ion concentration,chloride ion concentration,and plasma protein concentration of haemolymph were monitored in Manila clam Ruditapes philippinarum with different shell colors exposed to low salinity of 15 for 0,1.5,3,6,12,24 and 48 h to evaluate the toleration of the clam with different shell colors to low salinity stress.The results showed the minimal mortality(3.92%)was observed in the zebra color clam which had significantly higher haemolymph osmotic pressure than in the control group at 24 h(P＜0.05),all the three groups showing approximate haemolymph osmotic pressure to seawater at 48 h.The increasing haemolymph sodium concentrations was found in the three shell color groups,the peak level in the zebra group and pearl-white group clam, and significantly higher than in the control group at 24 h(P＜0.05).There were increase first in chloride ion concentration in the control group clams,but the zebra group and pearl-white group clam showed a trend of initial decrease in chloride ion concentration in the zebra color group and pearl-white color group,even though significantly higher than in the control group at 24 h(P＜0.05).The ATPase activity all had an increase process in gills of the three shell color groups,pearl-white clam showing significantly higher than the clam in the control group did at 6 h and 24 h(P＜0.05).The total hemocyte count(THC)was also fluctuated in the experiment,and the zebra group and pearl-white group clams had significantly lower THC than the clams in the control group(P＜0.05),but the zebra group had significantly higher than the clam in the control did at 48 h(P＜0.05).

Ruditapes philippinarum;shell color;low salinity stress;osmotic pressure;ATPase activity

S968.31

A

2012-07-02

國家 “863”計劃項目 (2012AA10A410-2);國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項經費資助項目 (CARS-48);大連海洋大學博士啟動基金資助項目 (SYBS201201)

丁鑒鋒 (1977-),男,博士,講師。E-mail:jfding@dlou.edu.cn

2095-1388(2013)03-0264-05