利用164個微衛(wèi)星標記分析鏡鯉家系的遺傳多樣性和經(jīng)濟性狀

徐浩,魯翠云,孫效文

(1.中國水產(chǎn)科學院黑龍江水產(chǎn)研究所淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室,黑龍江哈爾濱150070;2.大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院,遼寧大連116023)

利用164個微衛(wèi)星標記分析鏡鯉家系的遺傳多樣性和經(jīng)濟性狀

徐浩1、2,魯翠云1,孫效文1

(1.中國水產(chǎn)科學院黑龍江水產(chǎn)研究所淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室,黑龍江哈爾濱150070;2.大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院,遼寧大連116023)

利用來源于細菌人工染色體文庫 (Bacterial artificial chromosome,BAC)的164個微衛(wèi)星標記分析了鏡鯉Cyprinus carpio L.家系遺傳多樣性及標記與體質(zhì)量、體長、體高、體厚4個性狀間的相關(guān)性。結(jié)果表明:鏡鯉家系68個個體在164個微衛(wèi)星位點上共擴增出402條條帶,觀察雜合度 (Ho)為0.220 6～1.000 0,平均為0.62,多態(tài)性信息含量 (PIC)為0.243 9～0.702 8,平均為0.42,總體表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25≤PIC≤0.50),遺傳多樣性水平較高;利用SPSS 17.0的GLM模塊分析標記與性狀間的相關(guān)性,有25個標記與相應性狀相關(guān) (P＜0.05),其中6個標記與性狀的相關(guān)性達到極顯著水平 (P＜0.01),使用獨立樣本T檢驗和Duncan's多重比較找到了每個位點的優(yōu)勢基因型;利用NCBI的Blast模塊將各位點序列與斑馬魚的序列進行比對,有11個位點與斑馬魚基因相關(guān),一致度均在80%以上,其中6個基因功能已知。

鏡鯉;微衛(wèi)星;遺傳多樣性;體質(zhì)量;體長;體高;體厚;相關(guān)性分析

鯉科魚類種類多、分布廣,其營養(yǎng)價值高,對環(huán)境適應能力極強,一直以來都是中國最流行的養(yǎng)殖魚類,據(jù) 《2011年中國統(tǒng)計年鑒》數(shù)據(jù)顯示, 2010年鯉科魚類總產(chǎn)量為1 510萬t,占淡水魚類總產(chǎn)量 (2 225.6萬t)的67.8%,養(yǎng)殖范圍幾乎覆蓋全國;鯉科魚類又是養(yǎng)殖魚類育種研究工作積累最多的魚類[1],目前已培育出了錦鯉、荷包紅鯉、興國紅鯉等觀賞種類,以及德國鏡鯉、高寒鯉、建鯉等優(yōu)良養(yǎng)殖品種。其中,德國鏡鯉Cyprinus carpio L.由黑龍江水產(chǎn)研究所在20世紀80年代引入中國,經(jīng)過系統(tǒng)選育,培育出在抗寒力、抗病力等方面優(yōu)于原種德國鏡鯉的選育系[2],已被全國原種和良種審定委員會認定為良種,并得到推廣。不過,這些品種都是借助常規(guī)育種手段培育得到的,育種周期很長、盲目性高[3]。近年來,隨著鯉養(yǎng)殖面積的擴大,又出現(xiàn)了發(fā)病率大幅上升、生長性狀顯著衰退等現(xiàn)象,雖然引起這些現(xiàn)象的確切原因尚不清楚,但從遺傳理論和養(yǎng)殖經(jīng)驗方面推測,優(yōu)良品種與普通品種雜交以及近親繁殖所引起的種質(zhì)資源嚴重退化,很可能是其主要原因[4]。

微衛(wèi)星標記具有多態(tài)性高、共顯性、在基因組中隨機分布等特點,被認為是檢測群體遺傳多樣性的最佳方法之一,Li等[5]利用30個微衛(wèi)星標記分析了6個野生鯉群體的遺傳多樣性,結(jié)果6個群體均屬中度多態(tài)。Silverstein等[6]利用9個微衛(wèi)星引物對3個虹鱒群體進行遺傳多樣性分析,結(jié)果3個虹鱒品系均為高度多態(tài),種質(zhì)資源良好。同時,通過分析微衛(wèi)星標記與目標性狀的相關(guān)性,可獲得與該性狀基因緊密連鎖的位點,進一步對優(yōu)勢基因型進行富集,能夠很好地指導遺傳育種研究。基于微衛(wèi)星等分子標記的標記輔助育種,具有高效、準確、不受環(huán)境影響等特點[3],有效地彌補了采用常規(guī)手段育種的缺陷。魯翠云等[7]利用親本間遺傳多樣性數(shù)據(jù)計算遺傳距離指導育種,得到了很好的育種效果。陳松林等[8]利用牙鲆抗弧菌性狀標記進行育種,也得到了較好的育種效果。日本東京海洋大學Okamoto教授課題組利用QTL分析結(jié)果進行牙鲆抗淋巴囊腫病育種研究,并將抗病群體與生長快的牙鲆群體雜交,得到了幾乎不染病且生長速度快的新品系,已投入到實際生產(chǎn)中[9]。本研究中,作者利用來源于細菌人工染色體 (Bacterial artificial chromosome,BAC)文庫的164個微衛(wèi)星標記,對一個鏡鯉家系進行遺傳多樣性及經(jīng)濟性狀分析,旨在為鏡鯉種質(zhì)資源檢測、QTL定位以及分子輔助育種提供科學依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以黑龍江水產(chǎn)研究所松浦試驗站培育的德國鏡鯉選育系為祖父母本,經(jīng)過微衛(wèi)星標記分析,選擇遺傳差異較大的親本共構(gòu)建35個家系[7],再次檢測篩選出遺傳距離較大的親本建立單家系,從中隨機選取68個個體,分別在68個水族箱 (長、寬、高分別為60、36、37 cm)內(nèi)養(yǎng)殖,初始體質(zhì)量為1.4～22.8 g,每天投喂同種飼料,投喂量以飽食為準,養(yǎng)殖3個月后,作為試驗對象。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 參考 《分子克隆實驗指南》[10]中高分子量基因組DNA的制備方法,對所取樣品基因組進行提取和純化。

1.2.2 表型性狀的度量 根據(jù)中華人民共和國國家標準 《養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗》 (GB/T 18654.3-2008)中的方法進行體質(zhì)量、體長、體高、體厚的測量。

1.2.3 PCR擴增及基因型分析 本研究中所用引物由中國水產(chǎn)科學研究院設(shè)計并提供,由上海生工生物工程技術(shù)有限服務(wù)公司合成。PCR反應體系為15 μL,其中包括Taq DNA聚合酶 (1 U)0.2 μL,1×PCR buffer(2 mmol/L MgCl2、50 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris HCl、dNTPs各200 mmol/L, 0.01%gelatin,pH 8.3)11 μL,0.01 mmol/L上、下游引物各0.5 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 0.8 μL。PCR反應程序為:94℃下預變性3 min;94℃下變性30 s,58～64℃下退火30 s,72℃下延伸30 s,共進行26個循環(huán);72℃下再延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠在6 V/cm下電泳5～6 h,銀染顯帶,拍照,使用Gel-Pro Analyzer 4.5(Media Cybernetics Inc)軟件分析條帶分子量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 對基因型數(shù)據(jù)進行分析,用 Popgene 32(http://www.ualberta.ca/～fyeh)計算等位基因頻率 (P)、等位基因數(shù) (Na)、有效等位基因數(shù) (Ne)、觀察雜合度 (Ho)、期望雜合度 (He)。多態(tài)性信息含量 (PIC)的計算公式[11]為

其中:Pi、Pj分別為群體中第i和第j個等位基因頻率;n為某一基因座上的等位基因數(shù)。

使用SPSS 17.0軟件對試驗群體性狀數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗,再用GLM模塊檢驗164個微衛(wèi)星位點與體質(zhì)量、體長、體高、體厚性狀的相關(guān)性。對檢測到的與性狀顯著相關(guān)的微衛(wèi)星位點,做進一步的基因型差異顯著性分析,如果該位點只有2個基因型,采用獨立樣本T檢驗 (Independent-samples T test)進行分析;如果有3個或3個以上基因型,則進行單因素方差分析 (One-Way ANOVA)和Duncan's多重比較。

1.2.5 Blast比對 利用NCBI的Blast模塊 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 將與經(jīng)濟性狀相關(guān)的微衛(wèi)星位點序列與斑馬魚序列進行比對,找到位點所在或緊密連鎖的功能基因,進一步研究其對經(jīng)濟性狀的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增及基因型

用164個微衛(wèi)星標記對試驗群體進行PCR擴增,經(jīng)聚丙烯凝膠電泳檢測,均可表現(xiàn)出清晰、穩(wěn)定的條帶,并表現(xiàn)出一定的多態(tài)性,共擴增出402條條帶,片段長度為102～582 bp,等位基因數(shù)為2～4個不等,平均等位基因數(shù)為2.45個,部分聚丙烯凝膠電泳結(jié)果見圖1。

2.2 鏡鯉家系的遺傳多樣性

鏡鯉家系在 164個微衛(wèi)星位點上的 Ne為350.77,各位點介于1.374 0～3.995 5之間,平均為2.14;Ho為0.220 6～1.000 0,平均為0.62; PIC為0.243 9～0.702 8,平均為0.42,該鏡鯉家系總體表現(xiàn)為中度多態(tài) (0.25≤PIC≤0.50),遺傳多樣性水平較高 (表1)。

2.3 性狀數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗

圖1 鏡鯉家系在CAFS1170位點的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of CAFS1170 in the mirror carp family

表1 鏡鯉家系在164個微衛(wèi)星位點上的遺傳多樣性(部分數(shù)據(jù))Tab.1 Genetic diversity of mirror carp family in 164 microsatellite loci(partial data)

試驗群體的體質(zhì)量 (BW)、體長 (BL)、體高(BH)、體厚 (BT)4個性狀均屬于數(shù)量性狀,采用SPSS 17.0軟件的Shapiro-Wilk檢驗方法檢測性狀測量值是否符合正態(tài)分布,結(jié)果只有體高性狀數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布 (P＞0.05),根據(jù) Q-Q圖(quantile-quantile plots)結(jié)果,體質(zhì)量、體長性狀僅有1～2個點明顯偏離,選擇去除明顯偏離的數(shù)據(jù);體厚性狀數(shù)據(jù)整體有一定偏離,故使用Minitab 15軟件的Johnson轉(zhuǎn)換,最佳擬合選定的P值為0.05,修正后的體質(zhì)量 (BWX)、體長 (BLX)、體厚 (BTX)再次經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗,數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布 (表2)。

表2 體質(zhì)量、體長、體高、體厚正態(tài)分布檢驗Tab.2 Normal distribution test for body weight,body length,body height and body width

2.4 性狀數(shù)據(jù)間的相關(guān)性檢測

使用SPSS 17.0軟件檢測性狀數(shù)據(jù)間的相關(guān)性,先以原始數(shù)據(jù)每兩個一組繪制散點圖,初步判斷性狀數(shù)據(jù)間存在直線相關(guān)趨勢,直線相關(guān)要求變量服從正態(tài)分布,選擇Pearson相關(guān)系數(shù) (R),對修正后的數(shù)據(jù)進行檢驗,去除的數(shù)據(jù)按照數(shù)據(jù)缺失處理,選擇按對排除缺失值。結(jié)果表明,所有性狀間的R=0.144～0.901,其中除體高與體厚性狀的R值 (R=0.144,P=0.242＞0.05)外,其余性狀間的R值所對應的P值均小于0.01,具有極顯著性統(tǒng)計學意義 (表3)。

表3 體質(zhì)量、體長、體高、體厚之間的相關(guān)性系數(shù)Tab.3 Linear correlations among body weight,body length,body height,and body width

2.5 標記與各個性狀的相關(guān)性

使用SPSS 17.0軟件的GLM模塊檢驗164個微衛(wèi)星位點與體質(zhì)量、體長、體高、體厚性狀的相關(guān)性。結(jié)果表明,共有CAFS905等25個微衛(wèi)星位點與不同性狀表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性 (P＜0.05),其中CAFS1259、CAFS1266、CAFS1677、CAFS1678、 CAFS1757、CAFS2444共6個標記與相應的性狀間表現(xiàn)出極顯著的相關(guān)性 (P＜0.01);CAFS1285等13個位點僅與一種性狀相關(guān),CAFS1266等8個位點與兩種性狀相關(guān),CAFS1677等4個位點則與3種性狀相關(guān),特別是CAFS1677位點,與體質(zhì)量、體長、體高3種性狀的相關(guān)性均達到了極顯著水平(表4)。

表4 微衛(wèi)星位點與經(jīng)濟性狀相關(guān)性分析Tab.4 The correlation analysis between microsatellite loci and economic traits

對檢測到的與性狀顯著相關(guān)的微衛(wèi)星位點,進行基因型差異顯著性檢驗 (α=0.05),對于只有2個基因型的位點,采用獨立樣本T檢驗;對于有3個或3個以上基因型的位點,則采用單因素方差分析檢驗。結(jié)果表明,各位點基因型間均表現(xiàn)出顯著性差異。在CAFS1259等9個微衛(wèi)星位點上存在3個或3個以上基因型,其中,CAFS1259的168/ 165和165/165基因型,CAFS1285的432/400基因型,CAFS1757的169/166基因型,CAFS1963的371/357基因型,CAFS1975的275/257和257/257基因型,CAFS2019的166/161基因型,CAFS2208的180/180基因型,CAFS2225的365/347、365/ 340、340/340基因型,CAFS2324的152/152基因型均值顯著高于其他基因型 (P＜0.05),表現(xiàn)為相應性狀的優(yōu)勢基因型;在CAFS905等16個微衛(wèi)星位點上,只存在兩個基因型,其中,CAFS905的152/144基因型、CAFS1003的 227/217基因型、CAFS1154的259/251基因型、CAFS1170的195/ 195基因型、CAFS1266的 267/267 基因型、CAFS1302的300/300基因型、CAFS1526的190/ 190基因型、CAFS1677的 220/220 基因型、CAFS1678的477/473基因型、CAFS1737的288/ 288基因型、CAFS1758的 309/309 基因型、CAFS2131的107/107基因型、CAFS2182的282/ 282基因型、CAFS2196的 218/218 基因型、CAFS2409的243/243基因型、CAFS2444的358/ 358基因型均值顯著高于另一基因型 (P＜0.05),也表現(xiàn)為相應性狀的優(yōu)勢基因型 (表5)。

表5 25個微衛(wèi)星位點的不同基因型在各個經(jīng)濟性狀中的差異顯著性檢驗(部分數(shù)據(jù))Tab.5 Significant difference test of economical traits in 25 microsatellite loci(partial data)

2.6 Blast比對

使用Blast模塊將具有優(yōu)勢基因型的25個微衛(wèi)星位點序列與斑馬魚序列比對,結(jié)果25個微衛(wèi)星位點中共有11個位點與已知的基因相關(guān),一致度均在80%以上,其中6個相關(guān)基因功能已知,比對結(jié)果見表6。

表6 Blast比對結(jié)果Tab.6 Blast comparison

3 討論

鯉基因組存在基因復制現(xiàn)象[12],遠源雜交得到的F1代個體在一個位點上常會出現(xiàn)3個或3個以上的等位基因[13],從而造成難以分辨的基因分離結(jié)果。本研究中所用群體,是以遺傳差異較大的德國鏡鯉選育系親本作為祖父母本構(gòu)建的F1代,在F1代個體中利用SSR進行基因組掃描,篩選出各位點無基因復制且遺傳差異較大的個體構(gòu)建F2代。利用164個微衛(wèi)星標記在68個F2代個體中共檢測到402個等位基因,平均Na為2.45個,平均Ne為2.14個,二者稍有偏差,說明等位基因分布略有不均,可適當增加試驗魚個體數(shù)。Ho為0.220 6～1.000 0,PIC為0.243 9～0.702 8,表現(xiàn)為中度多態(tài),具有較高的遺傳多樣性水平,且無基因復制現(xiàn)象,育種效果很好,可用于進一步育種研究。

本研究中試驗群體性狀間的相關(guān)性為0.302～0.901(體厚與體高相關(guān)性為0.144,不具有統(tǒng)計學意義,因此不予考慮),相關(guān)系數(shù)值越接近1說明相關(guān)越密切。微衛(wèi)星位點與性狀間的相關(guān)性檢驗結(jié)果表明,共有25個微衛(wèi)星位點與性狀相關(guān),其中12個位點同時與2個或3個性狀相關(guān),同一個微衛(wèi)星位點與多個性狀相關(guān),這可能是由于基因連鎖或一因多效,但也有可能是性狀間具有顯著的相關(guān)性所致,即該位點只與一個性狀基因連鎖,而性狀間相關(guān)性較高,故也被檢測到與其他性狀顯著相關(guān),其中的作用機制尚需進一步研究探討,這也說明人們在分子水平上的研究還不夠深入。另外,各個性狀均與多個微衛(wèi)星位點相關(guān),說明數(shù)量性狀由多個基因控制,即一效多因。

CAFS2208位點經(jīng)Blast比對,與斑馬魚znf 296基因一致性高達91%,znf 296基因具有與鋅離子結(jié)合的相關(guān)功能,研究表明,鋅離子與魚類的增重具有相關(guān)性。崔立嬌等[14]發(fā)現(xiàn),在飼料中添加鋅離子可提高星斑川鰈幼魚的增重率。王慶奎等[15]發(fā)現(xiàn),飼料中添加鋅離子可提高點帶石斑魚的增重率、特定生長率、肥滿度等指標。CAFS1758位點經(jīng)Blast比對,與 prkcbb基因一致性高達 93%, prkcbb基因具有與雄性激素受體和金屬離子結(jié)合等相關(guān)功能。研究表明,在飼料中添加一定量的雄性激素,可有效提高鯉的產(chǎn)量,雄性激素和雌性激素混合劑對虹鱒魚種也有促生長作用。國內(nèi)外一系列研究結(jié)果表明,銅和鋅在飼料中是必不可少的微量元素,而在飼料中補充鐵、鋅、錳、銅,尤其是氨基酸微量元素,可使羅非魚生長、代謝、非特異性免疫力得到顯著提高[16]。CAFS2196位點與 thrab基因相關(guān),thrab基因除具有與金屬離子結(jié)合的相關(guān)功能外,還與類固醇激素、甲狀腺激素受體結(jié)合等相關(guān)功能。類固醇激素已經(jīng)被證實具有維持生命、調(diào)節(jié)性功能、促進機體生長發(fā)育、調(diào)節(jié)免疫力等重要作用,雄性激素也屬于類固醇激素。李文笙等[17]研究發(fā)現(xiàn),性類固醇激素可間接地刺激生長激素分泌并調(diào)節(jié)其基因轉(zhuǎn)錄水平?？惮F(xiàn)江等[18]發(fā)現(xiàn),外源類固醇激素可明顯加快中國對蝦的生長。甲狀腺激素主要對魚類的早期發(fā)育起著重要影響[19-20],這在大黃魚[21]、 牙鲆[22]等魚類中已得到證實。因此,CAFS2208、CAFS1758和 CAFS2196位點可以直接應用于育種研究。另外,還有8個微衛(wèi)星位點與已知基因可能存在連鎖關(guān)系,但基因相關(guān)功能未知或與所討論性狀的聯(lián)系尚不清楚,這些位點對生長性狀的影響有待進一步驗證。

不同的養(yǎng)殖方式、遺傳背景也會對微衛(wèi)星位點與性狀間相關(guān)性分析結(jié)果造成很大影響,本研究中所使用的試驗群體養(yǎng)殖于水族箱內(nèi),與池塘養(yǎng)殖相比,環(huán)境因素更易于控制,在飼料投喂、飽食程度上也更能得到保證,可充分體現(xiàn)遺傳因素對生長性狀的影響,但也必然造成部分分析結(jié)果與池塘養(yǎng)殖群體存在差異。邢新梅等[23]利用微衛(wèi)星標記對池塘養(yǎng)殖鏡鯉群體進行體型性狀分析,其中有18個微衛(wèi)星標記與本研究所用相同,而 CAFS1737、CAFS2131、CAFS2324這3個位點在本研究中與經(jīng)濟性狀相關(guān),但只有 CAFS1737位點在邢新梅等[23]的研究中體現(xiàn)出相關(guān)性。鄭先虎等[24]對一個鏡鯉家系進行體質(zhì)量、體長的QTL定位研究,結(jié)果CAFS1757位點與體質(zhì)量相關(guān),與本研究結(jié)果吻合,最終被定位到38號連鎖群。另外,本研究中部分位點在池塘養(yǎng)殖的全同胞家系190個個體中也表現(xiàn)出與經(jīng)濟性狀的顯著相關(guān) (此數(shù)據(jù)尚未發(fā)表),其中CAFS2409位點與體長、體高、體厚性狀相關(guān),與本研究結(jié)果相近;CAFS1526位點與體長、體高性狀相關(guān),在本研究中該位點與體高、體厚性狀相關(guān);CAFS1758位點與體厚性狀相關(guān),而本研究中該位點與體厚性狀不具有相關(guān)性。這說明CAFS1737、CAFS1757、CAFS1526、CAFS2409位點具有直接應用于育種研究的可能性,而其他位點尚需進一步驗證。此外,本研究中引物來源于BAC克隆,本質(zhì)上是基因組微衛(wèi)星,與EST-SSR相比具有更高的多態(tài)性,更能有效地體現(xiàn)連鎖基因的真實情況[25]。并且來源于BAC克隆的分析結(jié)果可以進一步被定位到染色體,實現(xiàn)與物理圖譜的整合,同時,一些標記緊密連鎖的基因也可能因此得到定位[26],這對基因組相關(guān)研究具有重要意義。

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Analysis of genetic diversity and economic traits in a mirror carp Cyprinus carpio L.family using microsatellite markers

XU Hao1,2,LU Cui-yun1,SUN Xiao-wen1

(1.National Local Joint Engineering Laboratory for Freshwater Fish Breeding,Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China;2.College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

In this study,164 microsatellite markers were selected from bacterial artificial chromosome BAC to analyze the genetic diversity and to mark the economic traits related to body weight,body length,body height,and body width in 64 individuals of a mirror carp Cyprinus carpio L.family.Results showed that a total of 402 alleles were found,and the value of average observed(Ho)was ranged from 0.220 6 to 1.000 0,with mean of 0.62.The value of polymorphic information content(PIC)was varied from 0.243 9 to 0.702 8,with mean of 0.42,indicating that the level of genetic diversity was moderate(0.25≤PIC≤0.50).The analysis of correlation between SSR markers and the economic traits by GLM procedure of SPSS 17.0 revealed that there were 25 SSR markers showing a significant(P＜0.05)impact on economic traits,in which 6 SSR markers showed very significant difference(P＜0.01).Superior genotypes were obtained using Duncan's multiple comparison and independent-samples T test. Through Blast analysis in NCBI,11 loci were found highly correlated(higher than 80%)with the gene of zebra fish,including 6 known function genes.

Cyprinus carpio L.;microsatellite;genetic diversity;body weight;body length;body height;body width;correlation analysis

S965.116

A

2012-09-25

公益性行業(yè) (農(nóng)業(yè))科研專項 (200903045);國家 “863”計劃項目 (2011AA100402-5);國家 “948”計劃項目 (2011-G12)

徐浩 (1986-),男,碩士研究生。E-mail:xuhao861128@sina.com

孫效文 (1955-),男,研究員。E-mail:sunxw2002@163.com

2095-1388(2013)03-0247-07