紅曲霉M1發(fā)酵糙米代謝產(chǎn)物抗S180細(xì)胞增殖效應(yīng)研究

王 婧, 王昌祿, 陳勉華, 楊 華, 李素珍, 王玉榮, 李貞景

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院/食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室,天津 300457)

紅曲既是中藥材又是食品,在我國和東南亞一些國家應(yīng)用已有上千年的歷史[1].紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)品中含有多種功能活性物質(zhì),具有降血脂、抑菌防腐、抗癌等功效,備受關(guān)注.紅曲色素主要由紅、橙、黃三類色素組成,紅色素及橙色素具有抑菌和防腐的功效,黃色素有細(xì)胞毒活性,可促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[2].Monacolin類物質(zhì)對高血脂有控制作用,其中主要功效來源于Monacolin K(MK),主要通過抑制膽固醇生物合成途徑中關(guān)鍵酶——羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的作用而起到降血脂的作用[3].紅曲中γ-氨基丁酸(GABA)是降血壓的有效成分,也有抗氧化及降血糖的作用[4].紅曲中桔霉素是一種真菌毒素,可引起腎臟腫大,尿量增多,腎小管擴(kuò)張和上皮細(xì)胞變性壞死等癥狀,因此,如何有效控制桔霉素產(chǎn)生,降低其在食物中的含量,已成為食品健康發(fā)展的關(guān)鍵[5].

發(fā)酵基質(zhì)對紅曲霉代謝產(chǎn)物組成及活性有顯著影響:紅曲霉發(fā)酵薏仁顯現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性[6];紅曲山藥比紅曲米表現(xiàn)出更強(qiáng)的降壓效果和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制活性,并且可產(chǎn)生更多的GABA和具有抗炎作用的色素組分[7];紅曲霉發(fā)酵的當(dāng)歸具有良好的減肥效果[8].

糙米具有大米所沒有的谷粒皮層和胚,含有多種保健功能成分,且皮層中較多的纖維類物質(zhì)可減少糞便中誘導(dǎo)有機(jī)體突變物與腸道上皮細(xì)胞的相互作用,從而降低癌癥風(fēng)險[9-10].

目前,市場中功能性紅曲米的發(fā)酵基質(zhì)多為大米,不利于紅曲功能性產(chǎn)品的多樣性開發(fā).本實驗用紅曲霉M1分別發(fā)酵大米(MR)和糙米(MBR),對其主要代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行對比,并通過MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二甲苯基四氮唑溴鹽)比色實驗,以MK標(biāo)準(zhǔn)品為參比,對MBR、MR乙醇提取物抗S180小鼠腹水瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)進(jìn)行初步研究,分析了功能性紅曲對腫瘤細(xì)胞的抑制作用,對紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物中MK是否為唯一抑癌因子進(jìn)行了探討,為開發(fā)特征活性紅曲功能性產(chǎn)品提供了理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糙米、大米均為市售;紅曲霉M1為天津科技大學(xué)食品生物技術(shù)實驗室保藏;乙腈、甲醇(色譜純),德國CNW公司;桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%),MK標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%),GABA標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%),MTT,均為美國 sigma公司;MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽),美國sigma公司;DMSO,北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司.

1.2 主要設(shè)備

8453型紫外可見分光光度計,美國安捷倫科技有限公司;1200s型高效液相色譜儀(配有紫外檢測器、熒光檢測器和B.04.03.SP1 87色譜工作站),美國安捷倫科技有限公司;Model 1680型酶標(biāo)儀,美國BIO-RAD公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(麥芽汁培養(yǎng)基):將一定量的大麥芽粉碎,加4倍于麥芽量的自來水,于55～60℃保溫糖化3～4 h,經(jīng)6～8層紗布過濾除去殘渣,煮沸、過濾,加水稀釋至糖度為10～12°Brix,用時添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂,121℃滅菌20 min.

種子液培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖60 g,蛋白胨20 g,NaNO310 g,MgSO4·7H2O 5 g,KH2PO410 g,自來水1 000 mL,121℃滅菌20 min.

固體發(fā)酵培養(yǎng)基:將糙米和大米分別與自來水以1(g)∶1(mL)的比例浸泡過夜,分裝入250 mL三角瓶中,每瓶20 g原料,自來水20 mL,121℃滅菌20 min.

1.3.2 紅曲霉固態(tài)發(fā)酵條件

將菌種接種于斜面培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)6～8 d,制成孢子濃度為2×106個/mL的孢子懸浮液,以每瓶5 mL接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)4 d,置于溫度27℃,濕度75%時培養(yǎng),35 d后取出.

1.3.3 紅曲色素色價測定方法

將發(fā)酵樣品于40℃烘干至恒重,粉碎,過40目篩,根據(jù)國標(biāo)GB4926—1985[11]方法測定其色價.

1.3.4 桔霉素測定方法

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將質(zhì)量濃度為500 μg/mL的桔霉素乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成質(zhì)量濃度為0,0.05,0.10,0.50,1.00,2.00,5.00,10.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列.

1.3.4.2 樣品處理[12]

將發(fā)酵樣品于40℃烘干至恒重,粉碎,過100目篩.準(zhǔn)確稱取0.500 0 g樣品,置于20 mL離心管中,加入8 mL體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇,超聲30 min,3 000 r/min離心10 min,重復(fù)3次,合并上清液,定容至25 mL,靜置30 min,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后待測.

1.3.4.3 色譜條件

色譜柱 Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm). 流動相 V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=70∶10∶20(用磷酸調(diào)pH值為2.66～2.68).檢測器 熒光檢測器.檢測波長 λex=331 nm,λem=500 nm.柱溫 25℃.流速:1 mL/min.進(jìn)樣量20 μL.

1.3.5 MK測定方法

1.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將質(zhì)量濃度為500 μg/mL的MK乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成質(zhì)量濃度為0,0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列.

1.3.5.2 樣品處理

同1.3.4.2.

1.3.5.3 色譜條件

到2049年，使現(xiàn)有的水土流失面積全部得到治理和鞏固，江河泥沙含量減少90%，農(nóng)業(yè)人均保水保土基本農(nóng)田面積達(dá)到0.15 hm2，森林覆蓋率達(dá)到45%以上，生態(tài)系統(tǒng)得到全面修復(fù)，生態(tài)環(huán)境全面進(jìn)入良性循環(huán)，全市實現(xiàn)江河清澈、山川秀美目標(biāo)，構(gòu)建起實現(xiàn)資陽水土保持生態(tài)文明夢新篇章。

色譜柱 Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相 V(乙腈)∶V(水)=6∶4;檢測器 紫外檢測器;檢測波長 λ=237 nm;柱溫 25℃;流速 1 mL/min;進(jìn)樣量 20 μL.

1.3.6 GABA測定方法

1.3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將質(zhì)量濃度為500 μg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)水溶液配制成質(zhì)量濃度為0,10,20,50,100,200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列.

1.3.6.2 樣品處理

將發(fā)酵樣品于40℃烘干至恒重,粉碎,過100目篩.準(zhǔn)確稱取0.500 0 g樣品,加入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的TCA溶液,30℃水浴2 h轉(zhuǎn)至離心管中,10 000 r/min離心10 min,用TCA定容至5 mL.吸取200 μL 樣品溶液,200 μL 衍生劑(OPA 80 mg,β-巰基乙醇80 μL,甲醇10 mL)和1 mL硼酸緩沖液(0.4 mmol/mL,pH 10.4),振蕩 5 min,經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾后立刻檢測.

1.3.6.3 色譜條件

色譜柱 Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相 V(NaCOOH·3H2O(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6‰))∶V(甲醇)∶V(乙腈)=3∶1∶1,pH 7.2;檢測器 紫外檢測器;檢測波長 λ=338 nm;柱溫 40℃;流速 1 mL/min;進(jìn)樣量 20 μL.

1.3.7 MTT法體外抑制S180小鼠腹水瘤細(xì)胞增殖實驗

1.3.7.1 樣品制備

分別稱取10.0 g MBR、MR,放入50 mL離心管中,加入16 mL 75%乙醇,超聲處理30 min,3 000 r/min離心10 min,重復(fù)3次,合并上清液,35℃烘干.

為保證細(xì)胞實驗中MBR、MR乙醇提取物中MK含量一致,檢測提取物中MK含量,通過計算,分別稱取一定量的MBR、MR乙醇提取物,備用.

1.3.7.2 紅曲霉M1發(fā)酵糙米和大米提取物體外抑制S180增殖實驗

從小鼠體內(nèi)抽取生長狀態(tài)較好的S180小鼠腹水瘤細(xì)胞,先后用紅細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)基清洗干凈,配成1×105個/mL細(xì)胞懸液,加至96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL.設(shè)置實驗組和對照組,實驗組分別加入不同濃度的MK標(biāo)準(zhǔn)品、MR和MBR乙醇提取物(終質(zhì)量濃度分別為50,25,12,6,3 μg/mL),每組4個平行,對照組加培養(yǎng)基(DMSO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均控制在0.1%以下).分別培養(yǎng)24,48,72 h,實驗終止前4 h加入50 μL MTT(5 mg/mL)溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,離心,棄去上清液,每孔加100 μL DMSO,490 nm處測定吸光值,計算抑制率.

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲活性物質(zhì)的檢測結(jié)果

發(fā)酵樣品中桔霉素、GABA和MK的液相色譜分析結(jié)果見圖1(a)、(b)、(c).

圖1 樣品中桔霉素、GABA、MK的高效液相色譜Fig.1 HPLC of citrinin、GABA、MK in samples

由圖1(a)、(b)、(c)及標(biāo)準(zhǔn)品保留時間可以得出,樣品中各物質(zhì)的保留時間分別為:桔霉素5.148 min;GABA 6.892 min;酸型MK 13.784 min,內(nèi)酯型MK 20.536 min.

2.2 不同發(fā)酵基質(zhì)對紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中活性物質(zhì)的影響

分別以糙米、大米為發(fā)酵基質(zhì),紅曲霉M1代謝產(chǎn)物MK、桔霉素、GABA產(chǎn)量及色價對比見圖2和圖3.

由圖2和圖3可知,不同發(fā)酵基質(zhì)對紅曲霉M1固體發(fā)酵產(chǎn)物中活性物質(zhì)的組成及含量均有很大影響.MBR乙醇提取物中MK總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為292.34 μg/g,是MR乙醇提取物的1.3倍.在未發(fā)酵糙米中,GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為115.01 μg/g,經(jīng)紅曲霉M1發(fā)酵后達(dá)到2.98 mg/g,提高了約25倍.經(jīng)紅曲霉M1發(fā)酵的MBR,產(chǎn)桔霉素和色素能力均低于MR,分別為MR的44%和47%.

圖2 MBR、MR中MK含量對比Fig.2 Contrast of MK content between MBR and MR

圖3 MBR、MR中桔霉素、GABA含量及色價對比Fig.3 Contrast of citrinin,GABA and color value between MBR and MR

在紅曲霉M1發(fā)酵產(chǎn)物中,MK主要以開環(huán)式酸型、閉環(huán)式內(nèi)酯型以及閉環(huán)結(jié)構(gòu)脫水后的酯化型三種形態(tài)存在.在人體中,內(nèi)酯型MK必須經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化為酸型結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮降低血脂的效果,酯化型MK因與酶結(jié)合的部位沒有—OH基團(tuán)而不具有抑制活性.因此,酸式構(gòu)型為紅曲調(diào)脂藥物的活性形式,它無需體內(nèi)的羥基酯酶參與水解也可直接發(fā)揮作用,從而減少了人體對肝、腎的負(fù)擔(dān)[13].由于酯化型MK為無功效結(jié)構(gòu),因此,在本實驗中,僅對MK的酸式構(gòu)型及內(nèi)酯構(gòu)型進(jìn)行檢測.由圖2可以看出,在MBR乙醇提取物中酸型及內(nèi)酯型MK均可檢測到,而MR乙醇提取物中未檢測到酸型MK.因此,以糙米作為發(fā)酵基質(zhì)更具優(yōu)勢.

在糙米和大米中,維生素、礦物質(zhì)元素、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)種類和含量各不相同,支鏈淀粉及纖維含量的差別影響著發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的溶氧量和持水性,會對紅曲霉生長及代謝造成一定的影響,從而引起代謝產(chǎn)物的變化.

2.3 MBR和MR乙醇提取物對S180小鼠腹水瘤細(xì)胞的體外抑制作用

24,48,72 h時MK標(biāo)準(zhǔn)品、MBR及MR乙醇提取物對S180小鼠腹水瘤細(xì)胞的抑制率見圖4(a)、(b)、(c).

圖4 24,48,72 h時MK及樣品對S180小鼠腹水瘤細(xì)胞的抑制作用Fig.4 Growth inhibitory effect of MK and samples on S180 cell at 24,48 h and 72 h

由圖4可以看出,作用時間相同并在一定 MK濃度范圍內(nèi),MK標(biāo)準(zhǔn)品、MBR和MR乙醇提取物對S180小鼠腹水瘤細(xì)胞的抑制率隨MK濃度的增大而增大;三者對S180小鼠腹水瘤細(xì)胞抑制作用強(qiáng)弱順序為:MBR＞MR＞MK,且MBR和MR的抑制效果顯著大于MK標(biāo)準(zhǔn)品(p＜0.01).

24 h內(nèi),由于作用時間較短,3種樣品對腹水瘤細(xì)胞的抑制效果不明顯,24～48 h內(nèi)抑制率增長較快,48～72 h內(nèi)抑制作用變化不大.總之,MK標(biāo)準(zhǔn)品、MBR和MR乙醇提取物對S180小鼠腹水瘤細(xì)胞的抑制率隨作用時間的延長而增大,呈一定的劑量依賴關(guān)系.48 h和72 h時,MK質(zhì)量濃度為50 μg/mL的MBR抑制率達(dá)到最大,約為80%.

研究表明[14],膽固醇的產(chǎn)生是腫瘤細(xì)胞增殖的必要條件,HMG-CoA還原酶(HMGCR)對腫瘤細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用.因此,包括lovastatin(結(jié)構(gòu)與MK完全一致)在內(nèi)的他汀類物質(zhì)對腫瘤細(xì)胞增殖有抑制作用,可預(yù)防性地減少癌癥的發(fā)病率[15-16].本實驗結(jié)果顯示,紅曲霉M1發(fā)酵產(chǎn)物對S180小鼠腹水瘤細(xì)胞抑制作用強(qiáng)于MK標(biāo)準(zhǔn)品,這可能是由于紅曲中除他汀類物質(zhì)對腫瘤細(xì)胞有抑制作用外,紅曲色素、酶類及紅曲多糖等活性物質(zhì)也有一定的抗炎調(diào)脂、調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化的作用,可多靶向地對腫瘤細(xì)胞起到預(yù)防及抑制作用.在MK濃度相同的條件下,MBR乙醇提取物對S180小鼠腹水瘤細(xì)胞抑制率高于MR乙醇提取物,可能是由于糙米中含有多種大米沒有的功能性成分,如米糠脂多糖、胚芽中的肌醇六磷酸等,對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生一定的抑制作用,也可能是在糙米發(fā)酵過程中產(chǎn)生了新的活性物質(zhì),增強(qiáng)了其抑制腫瘤的能力.因此,當(dāng)MK濃度相同時,紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物中多種活性物質(zhì)共同作用于S180小鼠腹水瘤細(xì)胞,使其具有比MK標(biāo)準(zhǔn)品更強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力,且MBR乙醇提取物對S180小鼠腹水瘤細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于MR乙醇提取物.

3 結(jié) 論

對紅曲霉M1發(fā)酵糙米(MBR)與大米(MR)代謝產(chǎn)物組成及含量進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:在MBR提取物中,酸型和內(nèi)酯型MK同時存在,總MK和GABA含量高于MR,紅曲色素色價及桔霉素含量低于MR.兩者相比,當(dāng)以紅曲霉為發(fā)酵劑,以大米作為發(fā)酵基質(zhì)時,更適合于紅曲色素的開發(fā);以糙米作為發(fā)酵基質(zhì),活性物質(zhì)的產(chǎn)量與安全性較高,更適用于功能紅曲的生產(chǎn).

由S180小鼠腹水瘤細(xì)胞體外抑制作用實驗可知,MBR、MR乙醇提取物和MK標(biāo)準(zhǔn)品均對其具有一定的抑制作用,當(dāng)三者M(jìn)K含量相同時,作用強(qiáng)度依次減小.可見,MK并不是紅曲霉M1發(fā)酵產(chǎn)物中唯一的抑癌因子,其對腫瘤細(xì)胞的抑制作用是多種活性物質(zhì)共同作用的結(jié)果.

發(fā)酵基質(zhì)的種類、狀態(tài)及營養(yǎng)成分影響著紅曲霉代謝產(chǎn)物的種類和組成,一些未知的生物活性物質(zhì)也可賦予紅曲產(chǎn)品新的功能.

本文研究了以糙米為發(fā)酵基質(zhì)時,紅曲功能活性物質(zhì)組成和產(chǎn)量的變化,為紅曲保健產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ).在今后的研究中,還可通過多種腫瘤細(xì)胞實驗、動物實驗對紅曲霉代射產(chǎn)物的抗腫瘤作用進(jìn)行進(jìn)一步的驗證,探究具有抑制作用的活性因子,并針對這些功能因子對紅曲霉代謝產(chǎn)物進(jìn)行深入研究.

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