不同時間點用紅花注射液治療腦出血大鼠對出血灶周圍神經(jīng)細胞Caspase-3的影響※

馬全瑞孫金萍馬江波劉廣輝梁 亮趙 劍馬新偉秦 毅

不同時間點用紅花注射液治療腦出血大鼠對出血灶周圍神經(jīng)細胞Caspase-3的影響※

馬全瑞1孫金萍2馬江波1劉廣輝1梁 亮1趙 劍1馬新偉1秦 毅1

目的比較早期不同時間用紅花注射液治療腦出血（ICH）模型大鼠對大鼠行為學及血腫周圍神經(jīng)細胞Caspase-3的影響。方法ICH大鼠模型制造成功后，在出血后0、6、12、24h用紅花注射液治療，同時設(shè)置ICH對照和正常對照。大鼠ICH 72h后處死，取腦，連續(xù)切片。結(jié)果神經(jīng)功能評分結(jié)果顯示，紅花預防組較ICH對照組降低；Caspase-3蛋白免疫組化結(jié)果顯示，紅花預防組陽性細胞數(shù)較ICH對照組減少；ICH 6h前各時間點給藥較6h后給藥陽性細胞數(shù)多；ICH 6h后不同時間點給藥，腦血腫周圍Caspase-3陽性細胞數(shù)隨著用藥時間的推遲而逐漸增多。結(jié)論紅花注射液治療ICH，使ICH大鼠的神經(jīng)功能得到一定程度的恢復；ICH 6h以后盡早使用紅花注射液治療腦出血的效果較好；紅花注射液對腦出血的保護機制可能是通過抑制細胞內(nèi)Caspase-3蛋白的表達而延緩細胞凋亡。

腦出血；細胞凋亡；紅花注射液

腦出血（ICH）是一種常見的腦部疾病，目前治療 ICH的手段和方法雖較以往有很大進步，但ICH患者的死亡率仍較高。近年來的臨床資料顯示，應用紅花等活血化瘀藥物治療急性期ICH具有一定的療效，但適當?shù)慕o藥時機仍存在爭議。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動物實驗用230～280g SD大鼠（雌雄對半），由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供。ICH大鼠模型制造成功后，在出血后0、6、12、24h時腹腔注射紅花注射液（劑量為1.5ml/kg/d），正常對照和出血對照腹腔注射等量生理鹽水。每組6只大鼠。另外，紅花預防組是用紅花治療24h后再制作ICH模型。每日進行神經(jīng)功能評分一次，各組大鼠均于ICH后第72小時處死。

1.1.2 主要試劑紅花注射液（批號070304，雅安三九藥業(yè)有限公司）；Ⅶ型膠原酶（sigma公司）；Caspase-3多克隆抗體（武漢博士德公司）。

1.2 方法

1.2.1 根據(jù)腦立體定位圖譜用大鼠腦立體定位儀確定Ⅶ型膠原酶的注射位置（中線右側(cè)旁開3.0mm，前囟后 0.2mm）；用牙科鉆在注射位置打孔，以可見硬腦膜為準；用微量進樣器注射，0.5U/μl Ⅶ型膠原酶和6.25U/μl肝素的混合液0.26μl。

1.2.2 免疫組織化學染色石蠟切片，二步法進行切片的免疫組織化學染色，其中一抗為兔Caspase-3多克隆抗體，DAB顯色后，在200 倍光鏡下觀察、拍照、計數(shù)，計算平均值（觀察范圍為血腫周圍2、4、6、8、10、12時鐘點六個位置中選擇五個不重復視野區(qū)）。

1.3 結(jié)果分析利用SPSS 11.5對數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，顯著性水準取α≤0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學評分依據(jù)Berderson評分標準對各組大鼠進行行為學評分，詳見表1。

2.2 免疫組織化學細胞核或細胞漿中呈棕黃色著色的細胞判斷為Caspase-3陽性細胞。ICH對照組及紅花預防組的陽性細胞多集中在血腫周圍腦組織，正常對照組也可見少量陽性細胞。與相同時間點的ICH對照組相比較，不同時間點紅花預防組的凋亡細胞數(shù)目明顯減少（P＜0.01）。在不同時間點的紅花預防組之間進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后 6h和 12h開始用紅花治療ICH的效果明顯優(yōu)于其它時間點用紅花治療ICH的效果，詳見表2。

表1 ICH后各組大鼠的神經(jīng)功能評分[(±s),n=6]

表1 ICH后各組大鼠的神經(jīng)功能評分[(±s),n=6]

注：▲P＜0.01，VS ICH對照組

組別 術(shù)前24h 術(shù)后0h 術(shù)后6h 術(shù)后12h 術(shù)后24h正常對照組 0 0 0 0 0 ICH對照組 2.67±0.52 2.83±0.41 2.83±0.41 2.67±0.52 2.83±0.41紅花預防組 2.00±0.63▲ 2.17±0.41▲ 1.67±0.52▲ 2.00±0.63▲ 2.17±0.41▲

表2 各組大鼠腦血腫周圍Caspase-3陽性細胞記數(shù)[(±s),n=6]

表2 各組大鼠腦血腫周圍Caspase-3陽性細胞記數(shù)[(±s),n=6]

注：▲：VS相同時間點的ICH對照組，P＜0.01；●：VS術(shù)后0h的紅花預防組，P＜0.01；◆：VS術(shù)前24h的紅花預防組，P＜0.01；★：VS術(shù)前24h的紅花預防組，P＜0.05

組別 術(shù)前24h 術(shù)后0h 術(shù)后6h 術(shù)后12h 術(shù)后24h正常對照組 3.33±1.50 3.83±2.32 3.50±1.38 4.50±1.38 5.00±2.00 ICH對照組 65.50±8.89 63.67±9.16 68.00±9.30 67.83±5.53 67.00±4.98紅花治療組 52.33±6.31▲ 54.50±8.14▲ 38.33±10.46▲●◆ 40.33±6.17▲●★ 45.83±7.25▲

3 討論

腦出血（ICH）后神經(jīng)細胞死亡的主要途徑之一就是細胞凋亡[1]。各種動物實驗表明，ICH后神經(jīng)細胞凋亡在ICH后4～6h開始出現(xiàn)，48～72h達到高峰[2]。目前認為，哺乳動物的細胞凋亡通路至少由死亡受體通路和線粒體通路構(gòu)成，但是這兩條凋亡途徑并不是孤立的，它們后期的共同途徑是激活Caspases信號通路，其中Caspase-3在細胞凋亡分子機制網(wǎng)絡(luò)中居核心地位，是哺乳動物細胞凋亡中的關(guān)鍵酶[3]。

中醫(yī)學認為離經(jīng)之血便為瘀血。如唐宗海在《血癥論》中曰：“既是離經(jīng)之血，雖是清血鮮血，亦是瘀血”。中醫(yī)學認為中風的本質(zhì)是血瘀，治療中風的根本也應該是活血化瘀，只是在治療時機上存在較大爭議。眾多醫(yī)家將活血化瘀藥物多在ICH的亞急性期（3d或以后）開始使用。

紅花為一種常見的活血化瘀類中藥，味辛微苦、性濕，歸心、肝經(jīng)，是活血通經(jīng)、祛瘀止痛之良藥。本研究使用紅花注射液治療ICH模型大鼠，其結(jié)果顯示，無論從行為學評價，還是從凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3方面評價，與ICH對照組相比較，使用紅花注射液治療ICH大鼠有明顯的保護效果。歐芹等在小鼠衰老模型上也觀察到紅花能夠降低腦細胞凋亡率[4]。其次，對比ICH后不同時機使用紅花注射液治療ICH大鼠的效果，結(jié)果顯示，與ICH 6h以后用紅花注射液治療組相比較，大鼠ICH的同時使用紅花注射液治療或在ICH前使用紅花注射液預治療均能明顯增加ICH血腫周圍Caspase-3陽性細胞數(shù)。另外，在制作ICH模型的同時給藥治療，觀察到有1例模型血腫周邊出現(xiàn)新鮮出血灶，提示腦出血 6h內(nèi)使用紅花注射液治療有可能造成腦內(nèi)二次出血?？赡芘cICH同時使用紅花注射液治療抑制了血小板聚集[5]，加重ICH有關(guān)。因此，在ICH 6h以內(nèi)應慎用紅花注射液。在大鼠ICH 6h后的三個不同時間點使用紅花注射液治療 ICH，其 Caspase-3陽性細胞又逐漸增多，提示ICH 6h以后盡早使用紅花注射液干預 ICH的效果比較理想，與文獻[6-8]報道一致。推測，紅花注射液對ICH大鼠的保護作用可能與抑制 Caspase-3蛋白的表達并降低神經(jīng)細胞的凋亡有關(guān)。紅花注射液對ICH的保護機制有待于進一步深入的研究。

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[5] 陳文梅,金鳴,吳偉,等.紅花黃色素抑制血小板激活因子介導的血小板活化作用的研究[J].中國藥學雜志,2000,35(11)：741-744.

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R743.34

A

1673-5846(2013)09-0029-02

1寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學系，寧夏銀川 750004

2寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科，寧夏銀川 750004

教育部“春暉計劃”合作項目基金（Z2011054）、寧夏高等學校研究重點項目基金（NGY2013056）和寧夏回族自治區(qū)自然科學基金（NZ12189）

秦毅，教授，寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)學院人體解剖學教研室。E-mail：qinyi9166@163.com。