重大潛在入侵害蟲番茄潛葉蛾的SS-COⅠ快速檢測技術(shù)

張桂芬，劉萬學(xué)，郭建洋，張毅波，萬方浩*中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 0093;農(nóng)業(yè)部外來入侵生物預(yù)防與控制研究中心，北京 0008

番茄潛葉蛾Tuta absoluta(Meyrick)，又名番茄麥蛾，是鱗翅目麥蛾科的一種重要害蟲。番茄潛葉蛾起源于南美洲，1917年首次在秘魯?shù)娜f卡約發(fā)現(xiàn)并被描述，20世紀(jì)中葉開始在南美洲蔓延。該蟲于1955年從秘魯傳播到智利南部的圣地亞哥，1964年從智利擴散到阿根廷的門多薩省，15年后在巴西的巴拉那州莫雷蒂斯縣發(fā)現(xiàn)。目前，番茄潛葉蛾已在南美洲的阿根廷、玻利維亞、巴西、智利、哥倫比亞、厄瓜多爾、巴拉圭、秘魯、烏拉圭、委內(nèi)瑞拉等國大面積發(fā)生危害，是當(dāng)?shù)胤训臍缧院οx之一(Cifuentes et al.，2011;EPPO，2005)。2004 年歐洲和地中海植物保護(hù)組織將其列為A1類檢疫性有害生物;然而，隨著國際貿(mào)易往來的日趨頻繁，2006年底在西班牙東部卡斯特利翁的一間溫室中發(fā)現(xiàn)了番茄潛葉蛾的危害(Desneux et al.，2010);之后，很快便在摩洛哥、突尼斯、芬蘭等20多個國家發(fā)現(xiàn)，近期又在希臘、埃及、約旦和伊拉克東北部發(fā)現(xiàn)其危害，使番茄生產(chǎn)遭受了嚴(yán)重打擊，堪稱世界番茄和馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的大敵(Cifuentes et al.，2011;CIP，1996;Desneux et al.，2010;EPPO，2005;Roditakis et al.，2010)。番茄潛葉蛾在歐盟各國的快速傳播蔓延，主要是由于番茄果實及其種苗在歐洲各國的隨意調(diào)運。因此，美國農(nóng)業(yè)部動植物健康檢驗局針對番茄潛葉蛾制定了嚴(yán)格的檢疫條例及詳細(xì)的操作程序，嚴(yán)禁從疫區(qū)國家進(jìn)口番茄及茄子果實以及茄屬、曼陀羅屬、煙草屬和番茄屬種苗，不得使用盛裝過上述物品的包裝箱等，以嚴(yán)防番茄潛葉蛾的傳入(USDA-APHIS，2012)。

番茄潛葉蛾以茄科的番茄為主要寄主植物，也可為害茄子、馬鈴薯、青椒、人參果、煙草等經(jīng)濟作物，龍葵、銀葉葵、擬刺茄、皂味茄等非栽培茄科植物，以及多刺曼陀羅、曼陀羅、光煙草等天然茄科植物;有報道稱，番茄潛葉蛾還可為害茄科的燈籠果和豆科的豇豆，以及茄科枸杞屬和錦葵科錦葵屬的植物等。番茄潛葉蛾可在寄主植物的整個生長期進(jìn)行為害，露地及保護(hù)地番茄均可嚴(yán)重受害(Balzan＆ Moonen，2012;Desneux et al.，2010;EPPO，2005)。如若防控不及時，番茄減產(chǎn)可達(dá)80% ～90%，甚至絕收;番茄產(chǎn)業(yè)遭受的經(jīng)濟損失達(dá)50%～100%。番茄潛葉蛾為小型蛾類昆蟲，成蟲主要將卵產(chǎn)于葉片背面或正面，以及芽、嫩莖或綠色果實上;幼蟲孵化后潛入葉片、莖稈或果實內(nèi)取食為害，老熟幼蟲主要在土壤中化蛹，也可在葉片表面或潛道內(nèi)化蛹(Desneux et al.，2010;EPPO，2005;To?evski et al.，2011;USDA-APHIS，2012)。在南非，除番茄潛葉蛾以外，斑潛蠅屬昆蟲也是番茄上的重 要 害 蟲 (Leite et al.，2004;Miranda et al.，2005)。

物種特異性 PCR(species-specific PCR，SSPCR)檢測技術(shù)具有譜帶單一的特點(張桂芬等，2012);而線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)為多拷貝，在等量樣品中更容易被放大和使用(Lin＆Danforth，2004)。因此，基于mtDNA細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因(cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ)的SS-COⅠ技術(shù)在入侵害蟲檢測監(jiān)測中已逐漸得到應(yīng)用(張桂芬等，2012;Zhang et al.，2011)。本研究采用SS-COⅠ技術(shù)與方法，從檢測阻截的角度，研究番茄潛葉蛾快速檢測技術(shù);同時，以我國常見的美洲斑潛蠅Liriomyza sativae Blanchard、南美斑潛蠅L.huidobrenisis(Blanchard)、三葉草斑潛蠅 L.trifolii(Burgess)、蔥斑潛蠅 L.chinensis(Kato)、豌豆?jié)撊~蠅 Phytomyza horticola Goureau、桃潛葉蛾Lyonetia clerkella L.等6種潛葉類害蟲為參照進(jìn)行種特異性檢驗，以梯度稀釋的單頭成蟲DNA及其卵和成蟲殘體DNA為模板進(jìn)行靈敏性檢驗，以期為番茄潛葉蛾的快速檢測與準(zhǔn)確識別提供依據(jù)，為有效防范番茄潛葉蛾入侵我國提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

番茄潛葉蛾由西班牙農(nóng)業(yè)與食品技術(shù)研究所(IRTA)贈送，室內(nèi)飼養(yǎng)種群，寄主植物為番茄;美洲斑潛蠅飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所南區(qū)溫室，寄主植物為菜豆;南美斑潛蠅采自云南省昆明市呈貢縣蔬菜生產(chǎn)基地，寄主植物為芹菜;三葉草斑潛蠅由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院昆蟲生態(tài)研究室贈送，寄主植物為番茄;豌豆?jié)撊~蠅采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院院內(nèi)花園，寄主植物為二月蘭;蔥斑潛蠅和桃潛葉蛾采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊科研中試基地，寄主植物分別為大蔥和桃樹。

1.2 DNA 提取

潛葉類害蟲 DNA的提取參照 To?evski et al.(2011)和張桂芬等(2012)的方法，并稍加改進(jìn)。分別取單頭番茄潛葉蛾、美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅、蔥斑潛蠅、豌豆?jié)撊~蠅、桃潛葉蛾等潛葉類害蟲成蟲，放入1.5 mL離心管中，加入液氮后以玻璃研磨棒充分研磨，然后以220 μL緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl、1 mmol·L-1EDTA、1%SDS、20 mmol·L-1NaCl，pH 8.0)分2 次清洗研磨棒。充分混勻后，加入5 μL蛋白酶K(20 mg·mL-1)，于60℃水浴1 h(中途混勻1次);然后，沸水浴8 min，加入 220 μL 氯仿/異戊醇(v∶v=24∶1)抽提液，輕柔混勻數(shù)十次后，冰上放置30 min;4℃、12000 r·min-1離心20 min，取上清液約400 μL移入另一離心管，加入800 μL預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，待出現(xiàn)少量絮狀沉淀后于-20℃放置30 min;4℃、12000 r·min-1離心20 min，小心棄去上清液。加入500 μL預(yù)冷的75%乙醇洗滌，4℃、12000 r·min-1離心15 min，小心棄去上清液;然后將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥30 min后每管加入100 μL超純水，充分溶解后于-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 番茄潛葉蛾SS-COⅠ引物的設(shè)計

從數(shù)據(jù)庫中調(diào)用已知的番茄潛葉蛾mtDNA COⅠ基因序列(GenBank登錄號為 JN417242.1;To?evski et al.，2011)，運用軟件 Primer Premier 5 將番茄潛葉蛾與美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉斑潛蠅、蔥斑潛蠅、豌豆?jié)撊~蠅、桃潛葉蛾等的COⅠ序列進(jìn)行比對分析(Scheffer et al.，2006;Wang et al.，2011)。選取變異位點較多的區(qū)段，并根據(jù)該區(qū)段的堿基序列設(shè)計1對番茄潛葉蛾特異性引物TAZJCE1/TAZJCF1，上游引物堿基序列為AGAATCGTAGAAAATGGAGCAGGTA，下游引物堿基序列為CTGGCAATGATAAAAGAAGGAG(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司協(xié)助合成)，引物擴增片段大小為256 bp。

1.4 SS-COⅠ引物的種特異性檢測

分別以單頭美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅、蔥斑潛蠅、豌豆?jié)撊~蠅以及桃潛葉蛾DNA為模板，番茄潛葉蛾為陽性對照，檢驗番茄潛葉蛾特異片段擴增引物TAZJCE1/TAZJCF1的種特異性。反應(yīng)體系為25 μL，包含 10 × PCR buffer 2.5 μL、dNTP(10 mmol·L-1)0.5 μL、Taq 聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL(美國 NEB 公司)、上游引物和下游引物(10 pmol·L-1)各 0.5 μL、模板 DNA 2.0 μL、超純水18.75 μL。擴增程序:94℃預(yù)變性5 min;30個循環(huán):94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 50 s;最后72℃延伸5 min。擴增反應(yīng)在ABI-9700 PCR基因擴增儀上運行。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物在1.0%(質(zhì)量)瓊脂糖(amresco)凝膠上以90 V電泳(Bio-Rad PowerPac Basic)分離45 min，然后以GelDoc Universal HoodⅡ型凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)分析電泳結(jié)果。每個種類分別檢測10頭。

1.5 SS-COⅠ引物對卵及成蟲殘體的擴增效果以及最低檢出閾值的測定

分別以提取的番茄潛葉蛾的卵以及成蟲殘體［包括單根觸角、頭部、胸部(1/2胸長)、腹部(1/5腹長)、前翅、后翅、前足、中足、后足］的DNA作為模板，對靶標(biāo)片段擴增效果進(jìn)行檢驗，卵或成蟲殘體分別檢測8粒(卵)或8頭(成蟲殘體)。此外，取單頭雌性成蟲原模板DNA溶液2 μL(80 ng·μL-1)以2倍遞減梯度稀釋至4.88 pg·μL-1，然后以不同濃度的 DNA 為模板(即80 ×103、40 ×103、20 ×103、10 ×103、5.0 × 103、2.5 × 103、1.25 × 103、625.0、312.5、156.25、78.125、39.06、19.53、9.76 和 4.88 pg·μL-1，相當(dāng)于 1/50、1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400、 1/12800、 1/25600、 1/51200、1/102400、1/204800、1/409600、1/819200 頭雌性成蟲)測定最低檢出閾值，共測驗10頭。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄潛葉蛾SS-COⅠ引物的種特異性

以番茄潛葉蛾及其他潛葉類昆蟲的DNA為模板，以所設(shè)計的特異性引物TAZJCE1/TAZJCF1進(jìn)行PCR擴增。檢測結(jié)果顯示，該引物只對番茄潛葉蛾具有擴增能力，對其他種類的潛葉類害蟲不具有擴增效果，表明該引物為番茄潛葉蛾的特異性引物(圖1)。

2.2 SS-COⅠ引物對卵及成蟲殘體的擴增效果

以番茄潛葉蛾的卵及成蟲殘體DNA為模板，以特異性引物TAZJCE1/TAZJCF1進(jìn)行PCR擴增。電泳檢測結(jié)果顯示，無論是單粒卵、成蟲的單根觸角、頭部、胸部、腹部，還是成蟲的足和膜質(zhì)的翅，均能擴增出清晰的靶標(biāo)條帶(圖2)。

2.3 SS-COⅠ引物對番茄潛葉蛾的檢出閾值

當(dāng)將單頭雌性成蟲的DNA模板進(jìn)行遞減梯度稀釋至312.5 pg·μL-1(相當(dāng)于 1/12800 頭)時，所有的個體均能擴增出特異性的靶標(biāo)片段;當(dāng)稀釋為156.25 pg·μL-1時，尚有 50% 的個體可擴增出清晰的條帶(圖3)。

圖1 SS-COⅠ引物TAZJCE1/TAZJCF1對番茄潛葉蛾及其他潛葉類害蟲的擴增結(jié)果Fig.1 Amplification pattern of mitochondrial DNA of Tuta absoluta and its related leafminer species using SS-COⅠ primers TAZJCE1/TAZJCF1

圖2 SS-COⅠ引物TAZJCE1/TAZJCF1對番茄潛葉蛾卵及成蟲殘體的擴增結(jié)果Fig.2 Amplification pattern of mitochondrial DNA from egg and adult debris of Tuta absoluta using SS-COⅠ primers TAZJCE1/TAZJCF1

圖3 SS-COⅠ引物TAZJCE1/TAZJCF1對番茄潛葉蛾的最低檢出量Fig.3 The detection efficiency for Tuta absoluta diluted female adult mitochondrial DNA using SS-COⅠ primers TAZJCE1/TAZJCF1

3 討論

番茄潛葉蛾為寡食性害蟲，以幼蟲在茄科植物的葉片、頂芽、嫩莖、花蕾、萼片、幼果等部位潛食或蛀食為害，嚴(yán)重影響茄科蔬菜、煙草及觀賞植物的產(chǎn)量和質(zhì)量，蛀食幼果形成的孔洞極易招致次生病原物寄生，導(dǎo)致幼果大量腐爛，若防控不及時或措施不得當(dāng)，會造成嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收(Desneux et al.，2010;EPPO，2005;To?evski et al.，2011;USDA-APHIS，2012)。番茄潛葉蛾常以卵或藏匿在寄主植物組織中的幼齡幼蟲，以及土壤中的蛹隨番茄果實、茄科植物或觀賞植物種苗遠(yuǎn)距離傳播擴散。我國目前雖尚沒有番茄潛葉蛾發(fā)生的報道，但該蟲在許多國家危害嚴(yán)重，且適生區(qū)范圍廣泛(Desneux et al.，2010;Povolny，1975)，進(jìn)一步傳播擴散趨勢明顯。因此，快速、準(zhǔn)確鑒定番茄潛葉蛾是有效防止其侵入我國、保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全和生態(tài)安全的必要前提，而以往的比較形態(tài)學(xué)鑒定法無法滿足快速鑒定和有效阻截的基本需求。本研究采用的SSCOⅠ分子標(biāo)記技術(shù)特異性強，可以區(qū)分番茄潛葉蛾與其他常見的潛葉類害蟲。此外，該技術(shù)靈敏度高，不僅可以檢測番茄潛葉蛾的單粒卵，還可檢測單根觸角、頭部、胸部、腹部以及膜質(zhì)的翅和角質(zhì)化程度較高的足等成蟲殘體;當(dāng)以梯度稀釋的成蟲DNA為模板進(jìn)行PCR擴增時，其最低檢測閾值為312.5 pg·μL-1，相當(dāng)于 1/12800 頭雌性成蟲。對靶標(biāo)序列的測序及GenBank比對結(jié)果顯示，該片段與番茄潛葉蛾的同源性為 100%(Betta?bi et al.，2012;To?evski et al.，2011)，而與其他昆蟲的同源性均低于 92%(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。這表明該檢測技術(shù)可用于口岸農(nóng)產(chǎn)品國際貿(mào)易中番茄潛葉蛾的檢測。

目前，已有多種分子標(biāo)記技術(shù)用于潛葉類害蟲的種類鑒定，如RAPD(random amplification of polymorphic DNA) 技術(shù)(邱一中等，2000; ??l et al.，2006)、RFLP(restriction fragment length polymorphism)技術(shù)(陳萍等，2002;Scheffer et al.，2001)、多重PCR技術(shù)(Miura et al.，2004)以及 DNA條形碼技術(shù)(Scheffer et al.，2006)等曾用于斑潛蠅屬害蟲的鑒定研究，且均取得了較好的效果。但上述方法各有優(yōu)缺點，或?qū)Νh(huán)境因子的變化較為敏感如RAPD技術(shù)，或操作繁瑣且DNA需求量比較大如RFLP技術(shù)，或需要對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化、測序及序列比對分析等如DNA條形碼技術(shù)。SSCOⅠ技術(shù)由COⅠ標(biāo)記技術(shù)轉(zhuǎn)化而來，具有重現(xiàn)性好、檢測靈敏度高，且譜帶單一等諸多優(yōu)點，因此適宜于大規(guī)?？焖贆z測分析(張桂芬等，2012)。

致謝:海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院的江雅琴同學(xué)協(xié)助完成部分試驗，特表感謝!

陳萍，溫碩洋，曾玲.2002.PCR-RFLP技術(shù)應(yīng)用于鑒定美洲斑潛蠅和番茄斑潛蠅的初步研究.武夷科學(xué)，18:60-64.

邱一中，吳文哲，蕭旭峰，石正人.2000.RAPD-PCR在六種斑潛蠅 (Liriomyza spp.)(雙翅目:潛蠅科)快速鑒定技術(shù)之應(yīng)用.中華昆蟲，20(4):293-309.

張桂芬，劉萬學(xué)，郭建英，呂志創(chuàng)，萬方浩，申香菊.2012.美洲斑潛蠅SS-PCR檢測技術(shù)研究.生物安全學(xué)報，21(1):74-78.

Balzan M V and Moonen A C.2012.Management strategies for the control of Tuta absoluta(Lepidoptera:Gelechiidae)damage in open-field cultivations of processing tomato in Tuscany(Italy).OEPP/EPPO Bulletin，42:217-225.

Betta?bi A，Mezghani-Khemakhem M，Bouktila D，Makni H and Makni M.2012.Genetic Analysis of Tunisian Populations of the Tomato Leaf Miner，Tuta absoluta Povolny(Lepidoptera:Gelechiidae)，Inferred from Mitochondrial Markers.http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/380746935?report=genbank＆log$ =nucltop＆blastrank=2＆RID=HSP03C0T01R.

Cifuentes D，Chynoweth R and Bielza P.2011.Genetic study of Mediterranean and South American populations of tomato leafminer Tuta absoluta(Povolny，1994) (Lepidoptera:Gelechiidae)using ribosomal and mitochondrial markers.Pest Management Science，67:1155-1162.

CIP(The International Potato Center).1996.Major Potato Diseases，Insects，and Nematodes.3rd ed.Centro Internacional de la Papa，Lima，Peru.

??l B，Tongu? A，?zgül O，Civelek H S and Kaya B.2006.The use of RAPD-PCR analysis in characterization of Liriomyza trifolii(Burgess，1880)，Liriomyza congesta(Becker 1903)，Agromyza apfelbecki Strobl，1902 and Chromatomyia horticola(Goureau，1851)species collected from Turkey.Turkiye Entomoloji Dergisi，30:243-253.

Desneux N，Wajnberg E and Tabone E.2010.Biological invasion of European tomato crops by Tuta absoluta:ecology，geographic expansion and prospects for biological control.Journal of Pest Science，83:197-215.

EPPO(European and Mediterranean Plant Protection Organization).2005.Tuta absoluta.Data sheets on quarantine pests.OEPP/EPPO Bulletin，35:434-435.

Leite G L D，Pican?o M and Jham G N.2004.Intensity of Tuta absoluta(Meyrick，1917)(Lepidoptera:Gelechiidae)and Liriomyza spp.(Diptera:Agromyzidae)attacks on Lycopersicum esculentum Mill.leaves.Ciência e Agrotecnologia，28:42-48.

Lin C P and Danforth B N.2004.How do insect nuclear and mitochondrial gene substitution patterns differ?Insights from Bayesian analyses of combined datasets.Molecular Phylogenetics and Evolution，30:686-702.

Miranda M M M，Pican?o M C，Zanuncio J C，Bacci L and da Silva é M.2005.Impact of integrated pest management on the population of leafminers，fruit borers，and natural enemies in tomato.Ciência Rural，35:204-208.

Miura K，Tagami Y，Ohtaishi M and Iwasaki A.2004.Application of molecular techniques to distinguish Liriomyza trifolii from L.sativae(Diptera:Agromyzidae)on tomato cultivation in Japan.Journal of Economic Entomology，97:964-969.

Povolny D.1975.On three neotropical species of Gnorimoschemini(Lepidoptera，Gelechiidae)mining Solanaceae.Acta Universitatis Agriculturae，23:379-393.

Roditakis E，Papachristos D and Roditakis N E.2010.Current status of the tomato leafminer Tuta absoluta in Greece.OEPP/EPPO Bulletin，40:163-166.

Scheffer S J，Wijesekara A，Visser D and Hallett R H.2001.Polymerase chain reaction-restriction fragment-length polymorphism method to distinguish Liriomyza huidobrensis from L.langei(Diptera:Agromyzidae)applied to three recent leafminer invasions.Journal of Economic Entomology，94:1177-1182.

Scheffer S J，Lewis M L and Joshi R C.2006.DNA barcoding applied to invasive leafminers(Diptera:Agromyzidae)in the Philippines.Annals of the Entomological Society of America，99:204-210.

To?evski I，Jovi'c J，Mitrovi'c M，Cvrkovi'c T，Krsti'c and Krnjaji'c S.2011.Tuta absoluta(Meyrick，1917)(Lepidoptera，Gelechiidae):a new pest of tomato in Serbia.Pesticides and Phytomedicine(Belgrade)，26:197-204.

USDA-APHIS(United States Department of Agriculture，Animal and Plant Health Inspection Service).2012.Surveillance Protocol for the Tomato Leaf Miner，Tuta absoluta，for NAPPO Member Countries.http:∥www.aphis.usda.gov/import_export/plants/plantexports/downloads/Tuta_absoluta_surveillanceprotocol_08-06-2012-e.pdf.

Wang S Y，Lei Z R and Wang H H.2011.The complete mitochondrial genome of the leafminer Liriomyza trifolii(Diptera:Agromyzidae).Molecular Biology Reports，38:687-692.

Zhang G F，Meng X Q，Min L，Qiao W N and Wan F H.2011.Rapid diagnosis of the invasive species，F(xiàn)rankliniella occidentalis(Pergande):a species-specific COⅠmarker.Journal of Applied Entomology，doi:10.1111/j.1439-0418.2011.01661.x.