體外發(fā)酵產(chǎn)氣技術(shù)在飼料營養(yǎng)價(jià)值評(píng)定中的作用

哈斯花 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 010020

20世紀(jì)初以來，由于體外產(chǎn)氣法能夠較好地模擬瘤胃中的發(fā)酵歷程和預(yù)測(cè)體內(nèi)物質(zhì)消化率，引起了營養(yǎng)學(xué)家們的興趣。我國用人工瘤胃法評(píng)定飼料營養(yǎng)價(jià)值已有將近20年的歷史。丁角立（1983）首次將人工瘤胃產(chǎn)氣法用于牛飼料營養(yǎng)價(jià)值的評(píng)定，并與體內(nèi)消化相比較，獲得了比較滿意的結(jié)果。1985年金得哲等用人工瘤胃氣法測(cè)定鹿常用飼料的營養(yǎng)價(jià)值，所測(cè)值與體內(nèi)法相比較，與活體內(nèi)、外的飼料有機(jī)物質(zhì)消化率呈極強(qiáng)的正相關(guān) （r2=0.9895）。王加啟、馮仰廉（1995）在瘤胃持續(xù)模擬技術(shù)的基礎(chǔ)上研究探索了持續(xù)發(fā)酵和收集氣體的方法，并強(qiáng)調(diào)發(fā)酵產(chǎn)氣的數(shù)量和組成是研究飼料特性的重要參數(shù)。另外，結(jié)果表明：體外產(chǎn)氣量與體內(nèi)的消化參數(shù)具有很高的相關(guān)性。此后，氣體技術(shù)被確定為評(píng)價(jià)飼料營養(yǎng)價(jià)值的有效方法之一。

體外產(chǎn)氣技術(shù)應(yīng)用十分廣泛，涉及到營養(yǎng)學(xué)、微生物學(xué)及環(huán)境科學(xué)等多個(gè)科學(xué)領(lǐng)域?，F(xiàn)今主要的研究方向有：

（1）評(píng)定反芻動(dòng)物飼料中的干物質(zhì)降解率和代謝能。

（2）體外產(chǎn)氣量與體內(nèi)消化率具有顯著的相關(guān)性，若考慮飼料中蛋白質(zhì)對(duì)產(chǎn)氣量的影響則能進(jìn)一步提高對(duì)動(dòng)物體內(nèi)消化率的預(yù)測(cè)。

（3）預(yù)測(cè)動(dòng)物的采食量兩步法是Tilley和Terry于1963年在一步法的基礎(chǔ)上提出的。該法以試管培養(yǎng)瘤胃液和飼料樣品模擬瘤胃消化來評(píng)定飼料的可消化性，即將飼料在瘤胃液中培養(yǎng)48h后再用胃蛋白酶（pH大約為2）培養(yǎng)48h，模擬真胃和部分小腸的消化過程，培養(yǎng)結(jié)束后分離出殘?jiān)M(jìn)行分析。兩步法可以在體外模擬瘤胃消化，多應(yīng)用于評(píng)定飼料中的干物質(zhì)及有機(jī)物在瘤胃中的降解率。

體外發(fā)酵法是評(píng)定反芻動(dòng)物飼料營養(yǎng)價(jià)值的一種非常有效的方法，可同時(shí)進(jìn)行大量樣本的測(cè)定。與體內(nèi)法相比，此法不需要大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其結(jié)果與體內(nèi)法具有高度相關(guān)性，已經(jīng)越來越多地應(yīng)用在反芻動(dòng)物飼料的營養(yǎng)研究上。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品：全混日糧。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院提供的內(nèi)蒙古白絨山羊4只。

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院。

時(shí)間：2011.03-2011.05。

實(shí)驗(yàn)試劑：緩沖液、胃蛋白酶溶液、培養(yǎng)液、0.2M鹽酸、工作液、A液、B液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

帶有永久性瘤胃瘺管的健康的內(nèi)蒙古白絨山羊4只，用吸管法在瘤胃的不同部位采集瘤胃液。全混日糧每天飼喂2次，自由飲水，專人管理，預(yù)試期 7d。

表1：實(shí)驗(yàn)全混日糧

（1）常規(guī)分析實(shí)驗(yàn)

全混日糧1和全混日糧2的成分檢測(cè)方法參照楊勝（1999）的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》。NFC%=100-(NDF%+CP%+Fat%+Ash%)。

（2）產(chǎn)氣量的測(cè)定

進(jìn)行另一批3個(gè)重復(fù)的培養(yǎng),將0.4g待測(cè)樣品干物質(zhì)置于特制的150mL酸奶瓶中,用60mL瘤胃稀釋液(20mL瘤胃液+40mL培養(yǎng)液)消化。記錄1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、12h、24h、36h 及 48h 各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量(具體記錄時(shí)間視實(shí)際產(chǎn)氣量而定)。采用Groot等(1996)描述的多相組合模擬模型gas(ml)=a1/(1+(k1/t))c1+……+an/(1+(kn/t))cn計(jì)算動(dòng)態(tài)消化產(chǎn)氣參數(shù)。式中∶a代表每一飼料組分理論上的最大產(chǎn)氣量(mL)；k為對(duì)應(yīng)飼料組分達(dá)到最大產(chǎn)氣量一半時(shí)所需時(shí)間（h）；而c是決定曲線形狀的參數(shù)；t為培養(yǎng)時(shí)間(h)。產(chǎn)氣開始后，按照表3中的時(shí)間點(diǎn)記錄產(chǎn)氣量，每次記錄后放氣，使注射器的刻度歸零，下一次記錄完畢后又返回到零刻度。前幾個(gè)小時(shí)內(nèi)產(chǎn)氣較多，記錄時(shí)間稍密一些，以后間隔的時(shí)間稍長一些，可以減少試驗(yàn)誤差。

（3）活體外pH和NH3-N發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定

在39℃厭氧條件下,將0.2g待測(cè)樣品干物質(zhì)置于特制的150mL酸奶瓶中,用30mL瘤胃稀釋液（10mL瘤胃液+20mL培養(yǎng)液）消化。每個(gè)培養(yǎng)設(shè)3個(gè)重復(fù)，待培養(yǎng)至24 h時(shí)立即測(cè)定發(fā)酵液的pH值，采用上海雷磁儀器廠PHS-3B型高精度酸度計(jì)測(cè)定。氨態(tài)氮含量的測(cè)定參照馮宗慈等（1993）提出的方法。

依次量取工作液0mL、1mL、2mL、4mL 和6mL，置于5個(gè)編號(hào)的50mL容量瓶內(nèi)，依次加入蒸餾水 10mL、9mL、8mL、6mL、4mL 中， 使之成為10mL，再用0.2M鹽酸定容至刻度處，此系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中每100mL溶液的含氮量分別為0mg、0.2mg、0.4mg、0.8mg 和 1.2mg。

準(zhǔn)確量取各標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4mL，分別置于5個(gè)容量為10mL的試管內(nèi)，各管內(nèi)依次加入A液2mL和B液2mL，搖勻、靜置10min后，用722分光光度計(jì)于波長700nm處比色，采用0.5cm的比色皿。用裝有蒸餾水的0號(hào)試管作為空白對(duì)照，測(cè)定各溶液的消光值。用消光值作為自變量、溶液含N量作為從變量導(dǎo)出回歸方程式。

取10mL瘤胃液于3500-4000r/min下離心10min，量取2mL上清液置于15mL試管內(nèi)，加入8mL0.2M鹽酸至10mL，搖勻，比色操作同上所述。把測(cè)得的消化值代入回歸公式，計(jì)算得到的結(jié)果再乘以樣品的稀釋倍數(shù)即為原樣品的氨氮含量。

（4）兩級(jí)離體實(shí)驗(yàn)方法

首先在厭氧、39℃條件下,用瘤胃液的稀釋液消化1.5g底物樣品 （稱取樣品1.5g，放入培養(yǎng)瓶中，每管加入120mL的緩沖液混勻，通入CO2，直到其達(dá)到飽和狀態(tài)。將其放入培養(yǎng)箱中，使其溫度達(dá)到38℃，然后加入30mL瘤胃液，測(cè)定pH值并通入CO2，達(dá)到飽和，pH值應(yīng)保持在6.7-6.9。利用1mol/L的NaCO3來加以調(diào)整），在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,每天搖動(dòng)2-3次。在培養(yǎng)開始后6h和24h，測(cè)定內(nèi)容物的pH值并加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。然后加入1mL 5%HgCl2、2mL1moL/L 的 NaCO3來抑制微生物的活動(dòng)，促進(jìn)沉淀。離心，棄上清液。然后加入胃蛋白酶150mL，在39℃、酸性條件（pH應(yīng)在1.5左右）下再消化48h。然而為了最大限度地體現(xiàn)底物中粗蛋白含量不同對(duì)底物活體外消化率的影響,在緩沖液的配制中不添加尿素。瘤胃液采自裝有永久性瘤胃瘺管且飼喂飼糧的精粗比例為40∶60的內(nèi)蒙古白絨山羊。培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)定殘?jiān)械腄M、CP和 NDF含量，計(jì)算得出 DMD、CPD和NDFD的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)分析結(jié)果

表2：全混日糧營養(yǎng)成分

從表2中兩種不同配比的全混日糧的營養(yǎng)成分可以看出，全混日糧1的DM%、CP%和NFC%比全混日糧2的高，全混日糧1的NDF%、Ash% 、Fat%比全混日糧2的低。

2.2 產(chǎn)氣量的測(cè)定結(jié)果

表3：0.4g底物體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的平均值

從表3中的結(jié)果可以看出，1-24h內(nèi)全混日糧2的產(chǎn)氣量大于全混日糧1的產(chǎn)氣量，差距很明顯；36-48h內(nèi)全混日糧1的產(chǎn)氣量大于全混日糧2的產(chǎn)氣量，差距不明顯。

圖1：兩種不同全混日糧對(duì)體外瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)氣量的動(dòng)態(tài)變化影響

2.3 NH3-N和pH的測(cè)定結(jié)果

表4：NH3-N和pH的測(cè)定結(jié)果

從表4中的結(jié)果可以看出，全混日糧2的氨氮濃度大于全混日糧1的氨氮濃度，全混日糧1的pH值大于全混日糧2的pH值。

2.4 兩級(jí)離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2：NH3-N標(biāo)線

表5：兩級(jí)離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表5中的結(jié)果可以看出，全混日糧2的DM%、Cp%、NDF%都比全混日糧1的高。

3 討論

3.1 累計(jì)產(chǎn)氣量

產(chǎn)氣量是一個(gè)可以綜合反映飼料可發(fā)酵程度的指標(biāo)，表現(xiàn)出瘤胃微生物活動(dòng)的總體趨勢(shì)，是反映飼料蛋白價(jià)值的綜合指標(biāo)。瘤胃內(nèi)的氣體的主要來源是瘤胃微生物消耗可溶性碳水化合物和其他營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生的低級(jí)脂肪酸、甲烷、氫氣、二氧化碳等代謝產(chǎn)物。體外產(chǎn)氣量在某種程度上可反映出反芻動(dòng)物料在動(dòng)物體內(nèi)的降解特性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同精粗比例的全混日糧1和2在48h處的累計(jì)產(chǎn)氣量分別為86.52mL和81.02mL。從圖1中可以看出：前12h內(nèi)，全混日糧2的產(chǎn)氣量大于全混日糧1的產(chǎn)氣量，差距明顯。24-48h內(nèi)，全混日糧1的產(chǎn)氣量大于全混日糧2的產(chǎn)氣量，差距不太明顯。這說明全混日糧2比全混日糧1容易被消化。

3.2 氨氮的含量

反芻動(dòng)物瘤胃液氨氮是瘤胃氮代謝中外源蛋白和內(nèi)源含氮物質(zhì)降解的重要產(chǎn)物，同時(shí)也是瘤胃微生物合成菌體蛋白的原料。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：由表4可知，兩種不同精粗比例的全混日糧的平均氨氮含量為18.42 mol/(g.mL)和 22.27mol/(g.mL)，全混日糧 2的氨氮含量高于全混日糧1的氨氮含量，這可能與全混日糧1中的CP含量較低有關(guān)。兩種全混日糧的氨氮濃度都在最佳濃度范圍之內(nèi)，因此這兩種全混日糧都可以被反芻動(dòng)物很好地利用。

3.3 pH值

pH值反映的是飼料發(fā)酵產(chǎn)生的總酸度，可以反映瘤胃的發(fā)酵水平。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（見表4），添加不同日糧的pH值在6.43-6.58之間變化，均處于正常生理范圍（pH值5.5-7.5），不會(huì)影響瘤胃的發(fā)酵功能。添加不同組成的日糧會(huì)直接影響飼糧蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)的降解水平。

3.4 DM、CP、NDF的降解率

從降解率（見表5）可以看出，動(dòng)物需求最多的營養(yǎng)成分是粗蛋白，而且粗蛋白要比其他營養(yǎng)成分降解的更多。因此，飼料的粗蛋白質(zhì)含量越高，消化率越高；粗纖維越多，則消化率越低。全混日糧中2號(hào)是比較合理的配料。國內(nèi)外的一些研究也表明，不同的飼料精粗配比對(duì)反芻動(dòng)物消化營養(yǎng)物質(zhì)是有影響的，本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論也與這種說法相符合。從表5中可以看出，DM、CP、NCF的有效降解率均為2號(hào)全混日糧高，可能是因?yàn)檫@種比例更有益于微生物的生長，瘤胃微生物的活性更高，生長速度更快，從而提高了其消化營養(yǎng)物質(zhì)的效率。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用常規(guī)分析法、體外產(chǎn)氣法和兩級(jí)離體法研究了兩種不同精粗比例的全混日糧的營養(yǎng)價(jià)值。瘤胃發(fā)酵體外模擬方法不受實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的限制，可以在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。瘤胃發(fā)酵體外模擬方法能正確地評(píng)估各種飼料的營養(yǎng)價(jià)值，并在生產(chǎn)實(shí)踐中實(shí)現(xiàn)不同飼料的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，充分發(fā)揮飼料間的正組合效應(yīng)。

從表3和表5的結(jié)果可知，全混日糧的總產(chǎn)氣量、氨氮的含量和pH值都比較接近。全混日糧2的DM、CP、NCF降解率均大于全混日糧1，全混日糧2的組合效應(yīng)比全混日糧1好。兩種不同比例全混日糧的降解率不同，其營養(yǎng)價(jià)值也不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)法具有高度的相關(guān)性?？傮w來說，兩種全混日糧均可以被反芻動(dòng)物利用，而且利用體外產(chǎn)氣法和兩級(jí)離體法來評(píng)定反芻動(dòng)物的飼料營養(yǎng)價(jià)值是可行的。

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