解纖維梭菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

王朗，劉志丹，王天民，吳筱，張翀，汪群慧，邢新會(huì)

1 北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083

2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)水利與土木工程學(xué)院，北京 100083

3 清華大學(xué)化工系教育部工業(yè)生物催化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084

木質(zhì)纖維素類(lèi)生物質(zhì)被認(rèn)為是第二代生物能源的主要原料，然而其致密牢固的分子結(jié)構(gòu)制約了其高值化利用。解纖維梭菌 Clostridium cellulolyticum 是一種能夠分泌纖維小體高效降解纖維素的反芻類(lèi)中溫纖維素降解菌[4-6]。纖維小體是一種具有降解纖維素、半纖維素和膠質(zhì)能力的胞外酶復(fù)合體，它普遍存在于厭氧菌中，能在打破和利用結(jié)晶纖維素方面起到至關(guān)重要的作用。然而具有纖維小體的多數(shù)是厭氧菌，它們的生長(zhǎng)速率慢，且培養(yǎng)密度不高，嚴(yán)重影響了厭氧類(lèi)纖維素降解菌的工業(yè)應(yīng)用。因此，對(duì)諸如C.cellulolyticum 類(lèi)的具有纖維小體的厭氧菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)，將有利于解決纖維素等生物質(zhì)能源底物降解的瓶頸。根據(jù)目前已有的文獻(xiàn)報(bào)道，C.cellulolyticum 的最佳生長(zhǎng)條件是34℃、pH 7，但由于對(duì)環(huán)境厭氧度要求高和代謝等方面的影響，它的培養(yǎng)密度較低，已有的最高培養(yǎng)細(xì)胞濃度也僅為0.863 g/L[8]。迄今為止，對(duì)C.cellulolyticum高密度培養(yǎng)的研究報(bào)道很少，常規(guī)培養(yǎng)時(shí)的最終細(xì)胞濃度(OD600)都在0.8左右[9]，制約了該菌的工程應(yīng)用。

本論文為了探討C.cellulolyticum 的高密度培養(yǎng)方法，以解纖維梭菌培養(yǎng)最常用的CM3培養(yǎng)基作為原始培養(yǎng)基[10-12]，利用響應(yīng)面法優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，并在發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，從而探索C.cellulolyticum 高密度培養(yǎng)的可能性及其發(fā)酵特性。響應(yīng)面法是一種快速有效優(yōu)化培養(yǎng)基的方法，它可以綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模，通過(guò)實(shí)驗(yàn)?zāi)M因素和結(jié)果的函數(shù)關(guān)系，得到局部的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果[13]。因此，近年來(lái)響應(yīng)面優(yōu)化在生物化學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[14]。本論文將為進(jìn)一步建立C.cellulolyticum 的高密度培養(yǎng)方法提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)條件

解纖維梭菌Clostridium cellulolyticum DSM 5812購(gòu)買(mǎi)于德國(guó)菌種保存中心 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)。所購(gòu)買(mǎi)的菌株經(jīng)CM3固體平板活化2代后，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需。

發(fā)酵培養(yǎng)基為CM3培養(yǎng)基：纖維二糖6 g/L，酵母提取物2 g/L，(NH4)2SO41.3 g/L，KH2PO41.5 g/L，K2HPO4·3H2O 2.9 g/L，MgCl2·6H2O 0.2 g/L，CaCl20.075 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.25 mg/L，刃天青1.0 mg/L，cystine-HCl·H2O 0.5 g/L，微量元素1.0 mL，F(xiàn)eCl2·4H2O 1.5 g，ZnCl270 mg，MnCl2·4H2O 100 mg，H3BO36 mg，CoCl2·6H2O 190 mg，CuCl2·2H2O 2 mg，NiCl2·6H2O 24 mg，Na2MoO4·2H2O 36 mg)。

培養(yǎng)條件是初始pH 7.2，溫度37℃，轉(zhuǎn)速170 r/min。培養(yǎng)用的種子菌是經(jīng)過(guò)液體培養(yǎng)40 h后的菌液。所有培養(yǎng)均在厭氧條件下進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 厭氧培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用的厭氧培養(yǎng)小瓶為50 mL 的血清瓶，裝液量是20 mL。將配制好的培養(yǎng)基分裝于血清瓶中，用橡膠塞密封，并用高純氮鼓氣以排除瓶?jī)?nèi)氧氣。鼓氣完畢后，將裝有培養(yǎng)液血清瓶置于高壓滅菌鍋中滅菌(121℃，15 min)，待冷卻后觀察培養(yǎng)基顏色，以刃天青為指示劑，培養(yǎng)液不出現(xiàn)粉紅色即可用于厭氧培養(yǎng)。所有的搖瓶實(shí)驗(yàn)都做3個(gè)平行，取平均值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 發(fā)酵罐批式培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)采用的是Sartorius Biostat A plus型發(fā)酵罐。有效容積5 L，裝液量為3 L。罐體內(nèi)發(fā)酵液的pH 是實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的，發(fā)酵罐則通過(guò)pH 的數(shù)據(jù)控制酸堿的泵。調(diào)節(jié)pH 用的酸為1 mol/L HCl溶液，堿為3 mol/L 的NaOH 溶液。種子菌在搖瓶培養(yǎng)40 h 后接入發(fā)酵罐。罐體內(nèi)一直通入氮?dú)庖员３职l(fā)酵罐的厭氧度。

1.2.3 菌體濃度測(cè)定

菌體生物量用比濁法進(jìn)行測(cè)定。在紫外分光光度計(jì)600 nm 的吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值，從而表征菌體生長(zhǎng)量。

1.2.4 產(chǎn)物分析

代謝副產(chǎn)物有機(jī)酸由高效液相色譜(HPLC-10A，SHIMADZU 公司)測(cè)定。液體樣品經(jīng)過(guò)離心(12000 r/min，10 min)，上清液用孔徑為0.22μm 的濾膜過(guò)濾后進(jìn)行分析。液相色譜選用Shodex RSpak KC-811有機(jī)酸分析柱，該柱尺寸為300 mm×8 mm。色譜分析條件為：柱溫40℃，流動(dòng)相為0.1%高氯酸，流速為1.0 mL/min，樣品進(jìn)樣量為20μL，選用示差檢測(cè)器。

1.2.5 酶活分析

菌液稀釋10倍，取0.5 mL 加入2 mL 羧甲基纖維素緩沖液(CMC-Na 1 g 溶解于100 mL 蒸餾水中，加入20 mLHAC-NaAC buffer (pH 7)混勻)。在34℃恒溫水浴鍋中糖化1 h，取出測(cè)還原糖濃度。定義在34℃和pH 7的條件下，1 min內(nèi)產(chǎn)生相當(dāng)于1μg 葡萄糖的還原糖量的酶量為1 U。其中還原糖濃度采用3,5-二硝基水楊酸比色法進(jìn)行測(cè)定[8]。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法

響應(yīng)面分析是多變量體系尋找最優(yōu)試驗(yàn)條件的一種簡(jiǎn)單策略，首先選定出最重要的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素，然后利用Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出顯著影響因素，對(duì)顯著影響因素進(jìn)行爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)，讓其接近最優(yōu)點(diǎn)區(qū)域，最后利用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析確定顯著影響因素的最優(yōu)值。即通過(guò)構(gòu)造一個(gè)具有明確表達(dá)形式的多項(xiàng)式替代試驗(yàn)，以近似描述目標(biāo)函數(shù)對(duì)設(shè)計(jì)變量的響應(yīng)特性。實(shí)驗(yàn)所采用的分析軟件為

Design-Expert v 8.0.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定顯著影響因素

Plackett-Burman 是可以利用最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)找到最重要的影響因素的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[15]，選定可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)2個(gè)水平，一個(gè)高水平(+1)和一個(gè)低水平(?1)，然后通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以模擬出一階多項(xiàng)式方程。模型所模擬出的公式為

式中，Y 是表征結(jié)果數(shù)，α0和αi是常系數(shù)，Xi是實(shí)驗(yàn)所涉及的影響因素。顯著影響因素的Prob＞F 值一般都小于0.05，也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況選定Prob＞F 值的界限值。顯著影響因素一般選定3個(gè)為最佳。因?yàn)?，隨著顯著影響因素的增多，后續(xù)實(shí)驗(yàn)次數(shù)就會(huì)增加(3個(gè)因素做20次，4個(gè)因素做31次)[12]。

本實(shí)驗(yàn)選取的11個(gè)因素分別是纖維二糖、酵母提取物、(NH4)2SO4、 KH2PO4、K2HPO4·6H2O、MgCl2·6H2O 的濃度，以及轉(zhuǎn)速、溫度、pH、接種量和一個(gè)虛擬變量。

在C.cellulolyticum 培養(yǎng)40 h 后，取樣在紫外分光光度計(jì)600 nm 處測(cè)定菌體的光學(xué)密度。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表1所示。在各因素實(shí)驗(yàn)中，最大的OD600值為0.578(表1中條件1所示)，而原始培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的OD600值為0.303(表1中條件12所示)。擬合的線性方程為

式中，R2為0.9998。表2顯示的是方差分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)選定的Prob＞F 值為0.05，該模型的Prob＞F 為0.0342，表明此模型有效。其中，纖維二糖濃度、酵母提取物濃度和培養(yǎng)溫度的Prob＞F 值分別為0.0336、0.0097和0.0460，表明它們均為菌體生長(zhǎng)的顯著影響因素。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果的一階多項(xiàng)式中各因素的系數(shù)及方差分析的結(jié)果，以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，用顯著影響因素效應(yīng)值的大小確定步長(zhǎng)，增加或者減少影響因素的實(shí)驗(yàn)值，從而達(dá)到的實(shí)驗(yàn)條件的中心點(diǎn)區(qū)域范圍[12]。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)?zāi)茏羁毂平畲箜憫?yīng)面區(qū)域，確定中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，并保證響應(yīng)面分析結(jié)果的有效性。

根據(jù)Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得到的顯著影響因素及數(shù)據(jù)，得出(NH4)2SO4、KH2PO4、K2HPO4·6H2O、MgCl2·6H2O 濃度，以及轉(zhuǎn)速、pH和接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。因此保持在(NH4)2SO41.3 g/L，KH2PO41.5 g/L，K2HPO4·3H2O 2.9 g/L，MgCl2·6H2O 0.2 g/L，CaCl20.075 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.25 mg/L，刃天青1.0 mg/L，cystine-HCl·H2O 0.5 g/L，微量元素1.0 mL，最初pH 7.2，轉(zhuǎn)速170 r/min，接種量10%。此外，纖維二糖和培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)存在負(fù)影響，在最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中數(shù)值應(yīng)該減小，酵母提取物存在正影響，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中數(shù)值應(yīng)該增大。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示，隨著3個(gè)顯著影響因素的不同變化，菌體濃度的變化趨勢(shì)是先增大后減小，其中條件5對(duì)應(yīng)的菌體濃度達(dá)到最大值，OD600值為0.586，響應(yīng)變量接近最大響應(yīng)區(qū)域。因此，實(shí)驗(yàn)條件5可以作為中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

表1 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Plackett-Burman experiment design and results

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experiment design and results of the steepest ascent path

2.3 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)逼近最優(yōu)值區(qū)域后，顯著影響因素設(shè)計(jì)5個(gè)不同水平(?1.682、?1、0、+1、+1.682)[16]，所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以擬合出二次多項(xiàng)式方程，然后數(shù)據(jù)的多元回歸能模擬出顯著影響因素的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。二次多?xiàng)式方程為

式中，Y 是預(yù)測(cè)響應(yīng)值，β0、βi、βij和βii是回歸系數(shù)，β0是截距，βi是一次系數(shù)，βii是二次系數(shù)，βij是相互系數(shù)，Xi和Xj是顯著影響因素。中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的二次多項(xiàng)式只有在考察的臨近區(qū)域才符合真實(shí)情況，遠(yuǎn)離此區(qū)域的點(diǎn)在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中幾乎是不存在任何意義的[11]。

根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)培養(yǎng)條件區(qū)域，以表3中條件5為中心點(diǎn)進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn)，選用臂長(zhǎng)為1.682，3個(gè)顯著影響因素設(shè)計(jì)20種實(shí)驗(yàn)條件，如表4所示。所得到的二次多項(xiàng)式為

式中，X1為纖維二糖濃度，X2為酵母提取物濃度，X8為溫度。該模型的R2為0.9145，表明91.45%的條件符合此模型，Prob＞F 為0.0003，說(shuō)明模型的顯著性較好，模型的F 值為11.89，表明此模型有效。

表4 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 4 Central composite design and results

表5 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸方程的方差分析Table 5 Statistical analysis of central composite design

2.4 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面的曲面圖解釋了顯著影響因素之間的相互作用，確定了最優(yōu)生長(zhǎng)情況下顯著影響因素的水平。結(jié)果如圖1所示，每個(gè)圖都表示在其他因素不影響的情況下，2個(gè)顯著影響因素之間的相互作用，顯著影響因素的值分別為X1=7，X2=3，X8=34。相應(yīng)的，其他值分別為(NH4)2SO41.3 g/L，KH2PO41.5 g/L，K2HPO4·3H2O 2.9 g/L，MgCl2·6H2O 0.2 g/L ， CaCl20.075 g/L ，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.25 mg/L，刃天青1.0 mg/L，cystine-HCl·H2O 0.5 g/L，微量元素1.0 mL，最初pH 7.2，轉(zhuǎn)速170 r/min，接種量10%。在此優(yōu)化下，C.cellulolyticum 菌體濃度OD600由0.303提高到0.586，增加了93.4%。

圖1 酵母提取物、纖維二糖濃度和培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響(A：酵母提取物和纖維二糖對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，B：培養(yǎng)溫度和纖維二糖對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，C：培養(yǎng)溫度和酵母提取物對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響)Fig.1 Influence of yeast extract concentration,cellobiose concentration and culture temperature on the growth of Clostridium cellulolyticum.(A) Response surface for the interaction between yeast extract concentration and cellobiose concentration affecting Clostridium cellulolyticum biomass at 34°C.(B) Response surface for the interaction between culture temperature and cellobiose concentration affecting Clostridium cellulolyticum biomass at yeast extract concentration of 3 g/L.(C) Response surface for the interaction between culture temperature and yeast extract concentration affecting Clostridium cellulolyticum biomass at cellobiose concentration of 7 g/L.

2.5 發(fā)酵罐批式培養(yǎng)

C.cellulolyticum 在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)采用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件。在沒(méi)有控制pH 的發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，菌體OD600在46 h 達(dá)到最大值為2.544(圖2)。為了進(jìn)一步提高細(xì)胞密度，將培養(yǎng)液pH控制在7.2，培養(yǎng)結(jié)果如圖3所示，菌體在72 h達(dá)到最大值OD600為3.432(相當(dāng)于細(xì)胞干重濃度1.94 g/L)。相比于搖瓶培養(yǎng)，在發(fā)酵罐上的生長(zhǎng)情況有很大幅度的提高。這主要可能和發(fā)酵罐攪拌更充分，傳質(zhì)效果更好有關(guān)。在pH 恒定的情況下，與相同條件下文獻(xiàn)報(bào)道的相比[11]，菌體濃度提高了2.8倍。

對(duì)比圖2和圖3可以看出，在不控制pH 的培養(yǎng)中，初始pH 為7.2，菌體在24 h 進(jìn)入了指數(shù)生長(zhǎng)期，糖利用率僅為26.15%，但酸的產(chǎn)生量很少。在46 h 時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，同時(shí)達(dá)到最大菌體濃度，此時(shí)的OD600值為2.544，pH降低至6.15，開(kāi)始產(chǎn)生酸，代謝產(chǎn)物主要以乙醇為主，指數(shù)期和穩(wěn)定期的起始時(shí)間與恒pH 發(fā)酵的時(shí)間差不多一致，然而在58 h 時(shí)細(xì)胞便進(jìn)入了衰退期，比恒pH 培養(yǎng)大約提前了14 h。46 h 后pH 降低程度增加，糖的利用率也很低，此時(shí)乳酸為主要有機(jī)酸。但總體而言，有機(jī)酸的量大大低于恒pH發(fā)酵。

圖2 無(wú)pH 控制下菌體的pH 變化和生長(zhǎng)曲線(A)及還原糖利用和代謝物(B)Fig.2 pH variation and growth (A),and changes in residue sugar and metabolite concentrations (B) without pH control.

圖3 恒pH 控制下菌體的pH 變化和生長(zhǎng)曲線(A)及殘留還原糖和代謝產(chǎn)物濃度變化(B)Fig.3 pH variation and growth (A),and changes in residue sugar and metabolite concentrations (B) with pH control.

從圖3可以看出，在恒pH 發(fā)酵培養(yǎng)中，pH一直控制在7.2，菌體在24 h 進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)乙醇大量生成。菌體在72 h 達(dá)到最大菌體濃度，此時(shí)OD600值為3.432，殘余糖含量?jī)H為31.55%，液相檢測(cè)到的糖成分主要為纖維二糖，未檢測(cè)到葡萄糖及阿拉伯糖的存在。隨著72 h后菌體進(jìn)入衰退期，代謝物大量生成，特別是甲酸、乙酸。但琥珀酸的含量一直很低。在發(fā)酵的96 h 時(shí)殘余糖含量為31.53%。影響菌體繼續(xù)生長(zhǎng)的原因可能為后期大量酸的生成和碳源的不足。

圖4 優(yōu)化前后菌體CMC 酶活性隨培養(yǎng)時(shí)間變化比較Fig.4 Comparison of CMC activities of cultures before optimization,after optimization,and after optimization with pH control.

纖維素降解菌對(duì)纖維素的降解性能是用酶活來(lái)進(jìn)行表征的。解纖維梭菌培養(yǎng)的關(guān)鍵就在于能夠在提高菌體密度的同時(shí)不對(duì)比酶活產(chǎn)生負(fù)面影響。圖4為恒pH 罐式發(fā)酵與優(yōu)化前后搖瓶培養(yǎng)菌體比酶活的對(duì)比。優(yōu)化前菌體的最大比酶活為0.29 U/OD600，優(yōu)化后的最大比酶活為0.34 U/OD600，恒 pH 罐式發(fā)酵最大比酶活是0.31 U/OD600，三種情況下菌體的比酶活基本相同。由此可以推測(cè)，在相同底物濃度和相同體積的條件下，隨著菌體密度增加，單位體積酶活性將相應(yīng)增加。因此，在保證比酶活的前提下，提高菌體密度是提高解纖維梭菌降解活性的一種有效途徑。

綜上所述，因?yàn)閜H 影響解纖維梭菌的代謝產(chǎn)物分布，控制發(fā)酵過(guò)程pH 是實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)的重要條件。

3 結(jié)論

通過(guò)Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響菌體生長(zhǎng)的各因素進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并有效地找出了顯著影響因素，最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)充分接近了最大響應(yīng)面區(qū)域，中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立了顯著影響因素的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)該模型進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)，優(yōu)化了內(nèi)在因素水平，中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析證明了C.cellulolyticum 培養(yǎng)條件優(yōu)化的有效性。最終優(yōu)化的培養(yǎng)條件是纖維二糖7 g/L，酵母提取物3 g/L，(NH4)2SO41.3 g/L，KH2PO41.5 g/L，K2HPO4·3H2O 2.9 g/L，MgCl2·6H2O 0.2 g/L，CaCl20.075 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.25 mg/L，刃天青1.0 mg/L，cystine-HCl·H2O 0.5 g/L，微量元素1.0 mL，最初pH 7.2，溫度34℃，轉(zhuǎn)速170 r/min，接種量10%。在50 mL 的搖瓶培養(yǎng)中優(yōu)化后的培養(yǎng)基菌體濃度比原始培養(yǎng)基菌體濃度提高了93.4%。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進(jìn)行恒pH 的發(fā)酵罐培養(yǎng)，菌體OD600值能達(dá)到3.432，比文獻(xiàn)報(bào)道的菌體密度提高了2.8倍。這為后續(xù)的研究提供了依據(jù)。

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