碳源種類及碳氮比對眼點擬微綠球藻生長密度、油脂含量和脂肪酸組成的影響

竇曉，陸向紅，盧美貞，薛蓉，晏榮軍，計建炳

浙江工業(yè)大學化學工程與材料學院浙江省生物質(zhì)燃料利用技術(shù)研究重點實驗室，浙江杭州 310014

石化燃料的日益匱乏和燃燒帶來的環(huán)境污染等問題都會影響人類的可持續(xù)發(fā)展，尋找綠色可再生能源是一項重要的戰(zhàn)略任務(wù)[1]。微藻因生長速率快、油脂含量高、無污染以及不占耕地等特點，在眾多生物質(zhì)能源原料中，受到格外關(guān)注[2-4]。

目前微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題就是成本過高，為了解決這個問題除了可以對微藻生物柴油生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)進行優(yōu)化之外，還可以提取高價值的副產(chǎn)物。眼點擬微綠球藻脂肪酸組成簡單，富含EPA[5]，是微藻生物柴油理想原料之一。

氮是微藻生長必需的大量元素之一，對于微藻的生長、繁殖等生理活動有著重要的作用[6]。碳元素大約占藻細胞干重的50%，是藻細胞的主要組成部分[7]，在微藻培養(yǎng)過程中適量加入碳源，有助于提高微藻生長的密度。氮元素對眼點擬微綠球藻生長影響的研究報道較多，碳元素對微藻生長的影響也有一定的研究：Roessler 等[8]的研究顯示豐富的碳源有利于積累更多的油脂；Regnanlt 等[9]發(fā)現(xiàn)不同的C/N 對微藻油脂合成具有顯著影響；陳潔等[10]的研究結(jié)果表明眼點擬微綠球藻偏喜重碳酸鹽型碳源，在培養(yǎng)時加入NaHCO3能夠提高微藻的生長密度；有報道提出眼點擬微綠球藻一般脂含量為28%，混養(yǎng)培養(yǎng)可達39%，如果混養(yǎng)培養(yǎng)中輔以蔗糖可達到54%[11]。他們的研究找到了眼點擬微綠球藻生長的最佳氮源NaNO3，證實了眼點擬微綠球藻能夠利用外在碳源，但是最適合眼點擬微綠球藻生長和油脂積累的碳源以及在不同的NaNO3濃度下不同C/N 對眼點擬微綠球藻生長密度、油脂含量和油脂組成的影響尚未見報道。本文采用連續(xù)充氣培養(yǎng)的方法，固定N/P=4∶1的條件下，考察了不同碳源、NaNO3濃度和C/N 耦合作用對眼點擬微綠球藻生長密度、油脂含量和脂肪酸組成的影響，以期篩選出眼點擬微綠球藻生長和油脂積累的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用眼點擬微綠球藻 Nannochloropsis oculata 來自海洋生物種質(zhì)庫，經(jīng)過涂布平板的方法純化之后，在本實驗室保存待用。

1.2 試驗過程

1.2.1 眼點擬微綠球藻的擴種

選取純化之后鏡檢無原生動物污染、生長狀況良好的眼點擬微綠球藻，在恒溫光照培養(yǎng)箱中用250 mL 錐形瓶進行擴種培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為20℃，連續(xù)光照，光照強度為3000 lx，培養(yǎng)期間每天定時搖動3次。

將培養(yǎng)至對數(shù)期的眼點擬微綠球藻放入5 L的培養(yǎng)瓶中進行進一步擴種培養(yǎng)，培養(yǎng)過程連續(xù)充氣，自然光照，培養(yǎng)溫度20℃～25℃。培養(yǎng)采用F/2培養(yǎng)基[12]，海水采用海水晶配制成的人工海水，pH 8.0。

1.2.2 實驗設(shè)計

取2 L 培養(yǎng)至對數(shù)期的眼點擬微綠球藻藻液，3000 r/min 離心去除營養(yǎng)鹽，得到待用藻泥。在相同的NaNO3濃度、N/P 下，設(shè)計4組實驗，第1組為對照組，第2、3、4組培養(yǎng)初期分別加入1 g NaCO3、1 g NaHCO3、1 g 葡萄糖，培養(yǎng)至穩(wěn)定期后再加入等量的碳源，選擇眼點擬微綠球藻生長的最佳碳源。以選取的最佳碳源為碳源，保持N/P 不變，配制不同NaNO3濃度和C/N 的培養(yǎng)液，具體數(shù)據(jù)見表1。

將去除培養(yǎng)鹽的眼點擬微綠球藻藻泥接種至1 L 的錐形瓶中，在連續(xù)通入無菌空氣，自然光照，室內(nèi)溫度20℃～25℃，pH 8.0的條件下培養(yǎng)。每隔24 h 取藻液在紫外分光光度計下測定OD440的吸光度。培養(yǎng)至穩(wěn)定期3 d 后，收集微藻，測定微藻的生物量及油脂含量。

改變眼點擬微綠球藻的接種密度，其余培養(yǎng)鹽配方和培養(yǎng)方法不變，考察不同接種密度下，NaNO3濃度、C/N 對眼點擬微綠球藻生長密度和油脂含量的影響。

1.3 分析方法

1.3.1 眼點擬微綠球藻細胞密度的測定

每隔24 h，采用紫外可見分光光度儀測定微藻溶液在440 nm 處的吸光值(OD440)，每個樣品重復(fù)測定3次，取平均值。

1.3.2 眼點擬微綠球藻油脂含量的測定

用1 mol/L 的NaOH 溶液將培養(yǎng)至穩(wěn)定期后3 d 的藻液的pH 值調(diào)至10.5，靜置24 h，去除上清液得到藻泥。藻泥中加入去離子水，3000 r/min離心5 min，去除上清液，此過程重復(fù)3次以去除培養(yǎng)鹽，將無培養(yǎng)鹽的藻泥在70℃的烘箱中烘干至恒重，采用改良酸法[13]測定藻粉中油脂的含量。

表1 不同培養(yǎng)鹽中NaNO3和NaHCO3濃度Table 1 Concentration of NaNO3 and NaHCO3 in different medium

1.3.3 眼點擬微綠球藻藻油成分的分析

藻油的甲酯化：將所得到的藻油用CHCl3溶解，轉(zhuǎn)入1.5 mL Agillient 玻璃瓶中，加入1 mL 1 mol/L 的硫酸甲醇溶液，充N2密封，于100℃反應(yīng)1 h，自然冷卻，加入200μL 去離子水，混勻，用200μL 正己烷萃取3次，合并有機相，用200μL 去離子水反萃取洗滌3次，取有機相，轉(zhuǎn)入1.5 mL Agillient 玻璃瓶中，N2吹干，稱重。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用定性分析：采用Aglient公司生產(chǎn)的7890-5973N 型氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)對甲酯化后微藻油脂中的脂肪酸甲酯進行定性分析。GC-MS 條件：DB-5MS 石英毛細管柱色譜柱(30 m×250μm×0.25μm)。柱升溫程序：初溫60℃，以10℃/min升至270℃，保持5 min，再以8℃/min升至300℃，保持8 min；操作條件：進樣口溫度270℃，色譜-質(zhì)譜接口溫度260℃；載氣：氦氣；載氣流速：1.0 mL/min；電離方式：El；電離能量：70 eV；測定方式：全掃描方式(SCAN)；掃描范圍：200～550 amu；進樣量：1μL。

氣相色譜定量分析：采用Aglient 公司生產(chǎn)的7890型氣相色譜儀(GC)，對甲酯化后微藻油脂中的脂肪酸甲酯進行定量分析。GC 分析條件：DB-WAX 毛細管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.50μm)。柱升溫程序：從50℃升至150℃，保持2 min；以10℃/min升至200℃，保持6 min；再以10℃/min升至230℃，保持5 min。載氣：氮氣；流量：3 mL/min。檢測器：氫火焰檢測器，氫氣：30 mL/min；空氣：300 mL/min。進樣口溫度：280℃；檢測器溫度300℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 眼點擬微綠球藻藻油脂肪酸組成和含量的確定

取甲酯化之后的眼點擬微綠球藻藻油，采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用定性分析脂肪酸的組成，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，眼點擬微綠球藻藻油由8種脂肪酸組成，分別是飽和脂肪酸：豆蔻酸(C14∶0)，棕櫚酸(C16∶0)，硬脂酸(C18∶0)；不飽和脂肪酸：棕櫚油酸(C16∶1)，油酸(C18∶1)，亞油酸(C18∶2)，二十碳四烯酸(C20∶4)，二十碳五烯酸(EPA，C20∶5)。采用氣相色譜儀(GC)對藻油進行定量分析，眼點擬微綠球藻藻油中棕櫚酸(C16∶0)，棕櫚油酸(C16∶1)，EPA (C20∶5)的含量比較大，分別為32%～45%，32%～49%，1%～15%。

2.2 不同碳源對眼點擬微綠球藻生長密度和油脂含量的影響

表2顯示了不同碳源對眼點擬微綠球藻生長密度和油脂含量的影響。可以看出外加碳源能夠提高眼點擬微綠球藻的生長密度，但是卻減低了微藻的油脂含量，這與Roessler 等[8]的研究結(jié)論“豐富的碳源有利于積累更多的油脂”矛盾，這可能是因為加入的碳源的量與他們有區(qū)別。在實驗室條件下，加入NaHCO3能夠獲得最大生物量，這與陳潔等[10]的結(jié)論相一致。從表中可以看出3種外加碳源中，無論是從生長密度還是油脂含量來看，無機碳源的促進作用都高于有機碳源葡萄糖，可能是因為眼點擬微綠球藻的生長更加偏重于利用無機碳源。兩種無機碳源中，眼點擬微綠球藻的生長和油脂積累更偏重于利用NaHCO3，這是因為NaHCO3和Na2CO3與培養(yǎng)液中添加的海鹽中的Mg2+、Ca2+等形成了沉淀，添加Na2CO3所形成的沉淀比NaHCO3多[14]，根據(jù)以上結(jié)論，此后的實驗采用NaHCO3為碳源。

2.3 C/N 對眼點擬微綠球藻生長密度的影響

圖1 眼點擬微綠球藻藻油甲酯的氣質(zhì)聯(lián)用總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram in GC-MS of fatty acid methyl ester of N.oculata.

表2 不同碳源對眼點擬微綠球藻生長密度和油脂含量的影響Table 2 Effects of different carbon sources on the the growth density and lipid content of N.oculata

圖2 不同C/N 對眼點擬微綠球藻生長密度的影響(接種密度OD440=0.70，NaNO3濃度分別為0.025 g/L(A)、0.075 g/L (B)、0.225 g/L (C))Fig.2 Effects of different C/N ratio on the growth density of N.oculata.Inoculation density at OD440 of 0.70,the concentration of NaNO3 at 0.025 g/L(A),0.075 g/L (B),0.225 g/L (C).

圖3 不同C/N 對眼點擬微綠球藻生長密度的影響(初始接種密度OD440=0.10，NaNO3濃度分別為0.025 g/L(A)、0.075 g/L(B)、0.225 g/L (C))Fig.3 Effects of different C/N ratio on the growth density of N.oculata.Inoculation density at OD440 of 0.10,the concentration of NaNO3 at 0.025 g/L(A),0.075 g/L (B),0.225 g/L (C).

沈和定等[15]研究了初始接種密度對微綠球藻生長密度的影響，結(jié)果表明最佳的初始接種密度為(50×104～200×104)個/mL，參考此研究結(jié)果，本論文選取初始接種密度285×104個/mL(OD440=0.70)和35×104個/mL (OD440=0.10)，研究NaNO3濃度和C/N 在不同初始接種密度下對眼點擬微綠球藻生長密度和油脂含量的影響。圖2和圖3分別為初始接種密度OD440=0.70和OD440=0.10時，在不同NaNO3濃度下C/N 對眼點擬微綠球藻生長密度的影響。可以看出NaHCO3濃度(C/N)對眼點擬微綠球藻生長密度的影響與初始接種密度和培養(yǎng)液中NaNO3濃度有關(guān)。在較低的NaNO3濃度時，NaHCO3濃度對微藻生長有較大影響：NaHCO3濃度存在飽和點，在低于飽和點時，隨著NaHCO3濃度的增加，眼點擬微綠球藻的生長速率增加；超過飽和點時，NaHCO3濃度的增加反而會抑制微藻的生長。但隨著NaNO3濃度的增加，NaHCO3對眼點擬微綠球藻生長速率的影響逐漸變小，這可能是因為在NaNO3濃度較低的時候，碳源是微藻生長的控制因子，隨著NaNO3濃度的提高，氮源成為微藻生長的控制因子。在不同的初始接種密度下，NaHCO3濃度的飽和點不同，當初始接種密度OD440=0.70的時候，NaHCO3濃度的飽和點為C/N=5，此時眼點擬微綠球藻的生長速率高于其他組；當初始接種密度 OD440=0.10的時候，NaHCO3濃度的飽和點為C/N=3，此時眼點擬微綠球藻具有較高的生長速率，這可能是因為在NaNO3濃度較低時，隨著接種量的增加，微藻生長所需的碳源的量有所增加。

在不同的初始接種量和NaNO3濃度下，C/N對眼點擬微綠球藻生物量的影響見表3，可以看出在不同的初始接種量和NaNO3濃度下，C/N 對眼點擬微綠球藻生物量的影響與其對微藻生長速率的影響保持一致；在相同的NaNO3濃度和C/N 下都表現(xiàn)為高的初始接種量能獲得高的生長密度，這與張海琪等[16]的結(jié)論相一致。

2.4 C/N 對眼點擬微綠球藻油脂含量的影響

在不同的初始接種密度和NaNO3濃度下，C/N 對眼點擬微綠球藻油脂含量的影響見圖4。兩種接種密度下都表現(xiàn)為：C/N 為1時，眼點擬微綠球藻的油脂含量最高；在相同的C/N 下，隨著NaNO3濃度的增加，微藻的油脂含量逐漸降低，這與Attilio Converti[17]的“氮缺陷有利于微藻油脂積累”的結(jié)論相符合；在相同的NaNO3濃度下，隨著C/N 的增加，眼點擬微綠球藻的油脂含量波動比較大，但都是在C/N=1時達到最大，這可能與微藻固定CO2及油脂代謝過程中的關(guān)鍵酶核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(簡稱Rubisco)有關(guān)，這個酶是光合作用碳固定以及油脂合成過程中的重要調(diào)節(jié)酶[18]，從微藻脂肪酸和油脂生物合成的途徑圖中可以看出[19]：在微藻油脂合成的過程中，C3循環(huán)是最基本的、最重要的一個步驟，此循環(huán)又包括3個階段：

1)羧化階段(CO2的固定階段)：RuBP (二磷酸核酮糖)+CO2→2 PGA (3-磷酸甘油酸)；催化酶：Rubisco (核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶)。

2)還原階段：PGA→GAP(甘油醛-3-磷酸)。

3)再生階段：RuBP 的再生。

Rubisco 的羧化活性和加氧活性需要在含有CO2及Mg2+的偏堿性pH 環(huán)境中活化[21-22]，根據(jù)活化動力學的分析，Lorimer 等[23]提出以下動力學模型：

表3 接種密度和C/N 對眼點擬微綠球藻生物量的影響Table 3 Effects of different inoculation density and C/N ratio to the growth density of N.oculata

E(鈍化)+ ACO2←→E-ACO2(鈍化)；

E-ACO2(鈍化)+Mg2+←→E-ACO2-Mg2+(活化)；

E 代表Rubisco 酶；ACO2代表起催化作用的CO2。

動力模型顯示Mg2+對Rubisco的羧化活性和加氧活性的活化起著很大的作用，當C/N 從1增加到3的時候，培養(yǎng)液中HCO3?量增加，溶液堿性增強，Mg2+的沉淀量增加，游離的Mg2+降低，不利Rubisco 酶的活化，從而導(dǎo)致微藻的油脂含量下降；當C/N 從3增加到7的時候，此時培養(yǎng)基中CO2的濃度變大，酶的活性對PGA 的生成速率的影響變小，底物CO2濃度的增加起主要作用，所以微藻的油脂含量又有所增加。

在兩種初始接種密度下，NaNO3濃度和C/N對眼點擬微綠球藻油脂含量影響的顯著性分析結(jié)果見表4。從表4可以看出，在兩種不同的接種密度下，都表現(xiàn)為眼點擬微綠球藻的油脂含量和NaNO3濃度顯著相關(guān)(P＜0.05)，與C/N 有相關(guān)性，但相關(guān)性相對較弱(P＞0.05)，這說明眼點擬微綠球藻的油脂積累受NaNO3的濃度和C/N 影響，但NaNO3濃度的影響更大。

2.5 C/N 對眼點擬微綠球藻油脂脂肪酸組成的影響

表5顯示的是C/N 對眼點擬微綠球藻油脂脂肪酸組成的影響。從表5可以看出，藻油的脂肪酸主要由棕櫚酸(C16∶0)和棕櫚油酸(C16∶1)組成。C/N 對藻油脂肪酸組成的影響與NaNO3濃度有關(guān)。在NaNO3濃度為0.025 g/L 時，隨著C/N 的增加，棕櫚酸含量下降，棕櫚油酸含量增加；在NaNO3濃度為0.075 g/L 時，隨著C/N 的增加，棕櫚酸含量增加，棕櫚油酸含量下降。

從表5還可以看當NaNO3濃度較低的時候，藻油的脂肪酸主要以飽和的和單不飽和脂肪酸為主，隨著NaNO3濃度的增加，藻油中的多不飽和脂肪酸含量也隨之增加。特別地，NaNO3濃度增加到0.225 g/L 時，藻油中EPA (C20∶5)含量大幅提高，達到10%以上。EPA 是一種良好的醫(yī)療保健品[24]，純度為99%的EPA 在國際上的售價已經(jīng)達到了200美元/g[25]，在獲取微藻生物柴油的時候得到高價值的副產(chǎn)物能在很大的程度上降低微藻生物柴油的成本。

圖4 不同的初始接種密度和NaNO3濃度下C/N 對眼點擬微綠球藻油脂含量的影響(初始接種密度分別為OD440=0.70(A)，OD440=0.10(B))Fig.4 Effects of C/N ratio on the lipid content of N.oculata at different inoculation density and the concentration of NaNO3.The inoculation density with OD440 of 0.70(A) and 0.10(B).

表4 不同的初始接種密度下NaNO3濃度和C/N 對眼點擬微綠球藻油脂含量影響的方差分析Table 4 The ANOVA of the effects of the concentration of NaNO3 and C/N ratio on the lipid content of N.oculata at different inoculation density

表5 C/N 和NaNO3濃度對眼點擬微綠球藻油脂肪酸組成的影響Table 5 Effects of C/N ratio and the concentration of NaNO3 on the fat acid constituents of N.oculata

C/N和NaNO3濃度對眼點擬微綠球藻藻油飽和、單不飽和、多不飽和脂肪酸含量影響的顯著性分析結(jié)果見表6。從表6中可以看出C/N 對眼點擬微綠球藻藻油脂肪酸組成成分的影響不顯著(P＞0.05)；眼點擬微綠球藻藻油脂肪酸的組成與NaNO3濃度的相關(guān)性隨著藻油脂肪酸不飽和度的增加而逐漸增加，微藻藻油中多不飽和脂肪酸的含量與NaNO3濃度極顯著相關(guān)(P＜0.01)，所以在培養(yǎng)眼點擬微綠球藻的時候適當?shù)靥岣逳aNO3濃度能夠大幅度地提高眼點擬微綠球藻藻油中多不飽和脂肪酸的含量，從而提高眼點擬微綠球藻在生產(chǎn)醫(yī)療保健產(chǎn)品上的價值。

表6 C/N 和NaNO3濃度對眼點擬微綠球藻油脂脂肪酸組成影響的方差分析Table 6 The ANOVA of the effects of the concentration of NaNO3 and C/N ratio on the fat acid constituents of N.oculata

2.6 眼點擬微綠球藻最佳培養(yǎng)條件的篩選

微藻培養(yǎng)的最終目標是獲得高的油脂產(chǎn)率，微藻油脂產(chǎn)率與微藻生長密度和油脂含量有關(guān)。

圖5 不同NaNO3濃度下，C/N 對眼點擬微綠球藻油脂產(chǎn)率的影響Fig.5 The effects of C/N ratio on the lipid productivity of N.oculata at diffient concentration of NaNO3.

3 結(jié)論

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