斑茅酶解轉(zhuǎn)化可發(fā)酵單糖的液氨預(yù)處理及參數(shù)優(yōu)化

劉建軍，彭何歡，趙相君，程成，陳峰，邵千鈞

浙江農(nóng)林大學(xué)工程學(xué)院國(guó)家木質(zhì)資源綜合利用工程中心，浙江臨安 311300

能源需求與環(huán)境保護(hù)是中國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展面臨的雙重壓力，我國(guó)的碳排放量已居世界第一，石油消費(fèi)量居世界第二。纖維素乙醇作為第二代燃料乙醇技術(shù)，受到各國(guó)政府與研究者的高度重視。纖維素乙醇燃料與汽油相比，能消減溫室氣體排放86%[1]。我國(guó)宜耕邊際性土地資源豐富，預(yù)計(jì)生產(chǎn)乙醇的總潛力為7.4×107t 以上[2]，可替代1/3以上的汽油消費(fèi)量。斑茅 Saccharum arundinaceum Ratz，又名大密，是禾本科甘蔗屬多年生、密叢高大草本，最近研究者根據(jù)基因表達(dá)將其劃歸為蔗茅屬Erianthus。斑茅的稈粗壯，高2～4 m (最高可達(dá)6 m)，莖達(dá)1～2 cm，具有分蘗力強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)、抗旱性強(qiáng)等特性，廣泛分布在我國(guó)熱帶、亞熱帶至暖溫帶的廣大區(qū)域，具有生物產(chǎn)量高、較高的光合效率和干物質(zhì)積累的能力。其灰分與木質(zhì)素含量低、纖維素含量較高，從化學(xué)成分及能值上看斑茅很適合作能源植物[3]。

木質(zhì)纖維素原料來(lái)源于植物細(xì)胞壁，主要成分是半纖維素、纖維素和木質(zhì)素等，其中纖維素的成分是葡聚糖，經(jīng)水解后可轉(zhuǎn)化為葡萄糖，半纖維素的主要成分為木聚糖、阿拉伯聚糖、甘露聚糖等，經(jīng)水解后可轉(zhuǎn)化為木糖、阿拉伯糖、甘露糖等，單糖經(jīng)發(fā)酵可轉(zhuǎn)化為乙醇(五碳糖發(fā)酵需要經(jīng)基因工程改進(jìn)后的菌種)。植物具有很強(qiáng)的水解頑抗性，被學(xué)者稱為生物質(zhì)頑抗(Biomass recalcitrance)[4-5]。木質(zhì)素將纖維素緊緊包裹，并形成共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(Lignin-carbohydrate complexes，LCCs)，半纖維素纏繞其中，再加上植物材料本身的致密性和纖維素的高結(jié)晶度，使水解酶難以接觸到纖維素，導(dǎo)致酶解效率低下。預(yù)處理技術(shù)可去除部分木質(zhì)素，瓦解纖維素的晶體結(jié)構(gòu)，部分降解半纖維素，暴露纖維素的核心部分，使其在酶的作用下高效地水解成可發(fā)酵的單糖。預(yù)處理是纖維素乙醇轉(zhuǎn)化過(guò)程中最重要的關(guān)鍵技術(shù)[4]，生產(chǎn)成本高達(dá)30美分/加侖乙醇[6]，占纖維素乙醇生產(chǎn)成本的1/4～1/3。預(yù)處理的主要方法有：酸預(yù)處理、堿預(yù)處理、熱水預(yù)處理、蒸汽爆破法和氨纖維爆破法等[6-8]，處理效果各有優(yōu)劣。

氨是價(jià)格低廉的堿性原料，可采用氨的水溶液或純液氨進(jìn)行預(yù)處理。氨水預(yù)處理根據(jù)處理溫度、氨含量與水分不同，主要有ARP 法(Ammonia recycle percolation)[9-10]、SAA 法(Soaking in aqueous ammonia)[11]和LMAA 法(Low moisture anhydrous ammonia)[12]等。以玉米秸稈為原料，纖維素酶的添加量為每克葡聚糖15 FPU/(g 當(dāng)量葡聚糖)，72 h 的葡聚糖轉(zhuǎn)化率(葡萄糖得率與理論最大值之比)：ARP 法為88.5%[9]和90.1%[10]，SAA 法為92.5%(10 FPU/(g 當(dāng)量葡聚糖))[11]；LMAA 法的乙醇得率為理論最高值的89%[12]。

純液氨處理主要采用氨爆法(Ammonia fiber explosion，AFEX)，玉米秸稈在優(yōu)化條件下，葡聚糖的轉(zhuǎn)化率在95%以上，而木聚糖的轉(zhuǎn)化率為80%以上[13]。AFEX 用于草本植物的效果良好，除玉米秸稈外，還用于稻草[14]、甜高粱秸稈[15]、青貯玉米[16]、芒[17]、柳枝稷[18-19]等。

本文提出的液氨處理法(Liquid ammonia treatment，LAT)在AFEX 的基礎(chǔ)上作了改進(jìn)，提高了溫度處理范圍(AFEX 認(rèn)為90℃具有最佳的處理效果)，并將氨的快速釋放改為緩慢釋放，降低了工藝控制難度與處理成本。LAT 法能移除一部分木質(zhì)素，不會(huì)使半纖維素分解后的木糖降解，氨易于回收再利用，預(yù)處理過(guò)程中不產(chǎn)生阻礙酶解或發(fā)酵的物質(zhì)，LAT 法預(yù)處理的優(yōu)勢(shì)與AFEX 法相似。斑茅轉(zhuǎn)化燃料乙醇的相關(guān)研究目前報(bào)道還不多，由于它的生物形態(tài)和化學(xué)組分與能源草本植物芒的相近，本文的結(jié)果將與芒的預(yù)處理研究結(jié)果進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)采用的生物質(zhì)原料為一年生斑茅、芒和玉米秸稈，均采自浙江省臨安市浙江農(nóng)林大學(xué)平山實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)(北緯30.23°、東經(jīng)119.72°)，斑茅和芒的采收期為12月份，玉米秸稈采收期為7月份(播種至青穗采收約65 d)。實(shí)驗(yàn)采用了地上部分的整株植物，將其切割成約1～2 cm 長(zhǎng)條狀，40℃烘干至含水率低于15%，用FZ102微型植物粉碎機(jī)粉碎成50～100目的粉末。經(jīng)混合均勻后采用水分分析儀MA35(賽多利斯)測(cè)得其含水率，并用塑料袋密封后置?20℃冰箱中存放備用。

用于高效液相色譜(HPLC)分析的葡萄糖、木糖等標(biāo)準(zhǔn)品均采購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司，純度為99%以上。

添加的水解酶為纖維素酶(Novozyme NS50013)、β-葡萄糖苷酶(Novozyme NS50010)及木聚糖酶(山東澤生生物科技有限公司)。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)分析方法參照了美國(guó)的國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(National renewable energy laboratory，NREL)制訂的實(shí)驗(yàn)規(guī)程(Laboratory analytical procedure，LAP)，部分實(shí)驗(yàn)在相關(guān)規(guī)程上有適當(dāng)改進(jìn)(見(jiàn)下述方法表述)。

1.2.1 組分含量測(cè)定

生物質(zhì)中碳水化合物和酸不溶性木質(zhì)素(Klason 木質(zhì)素)的含量采用酸水解法測(cè)定，碳水化合物組分由LAP002確定，酸不溶性木質(zhì)素由LAP003測(cè)定。LAP002和LAP003均采用酸解法，可以在一次實(shí)驗(yàn)中完成。

酸水解的具體步驟是先準(zhǔn)確稱量已知含水率并去除抽提物的生物質(zhì)原料約0.3 g，加入72%硫酸3 mL，在30℃水浴中保持2 h，加去離子水84 mL (稀釋至4%硫酸)，放入滅菌鍋中121℃保持1 h。經(jīng)真空過(guò)濾后將濾紙上的固形物烘干至恒重，用HPLC 法(色譜分析柱為Aminex HPX-87H 醇酸柱，美國(guó)Bio-Rad 生產(chǎn))測(cè)定各種單糖的濃度，并計(jì)算出葡聚糖(纖維素)、木聚糖、阿拉伯聚糖等含量，由濾紙上的固形物質(zhì)量確定不溶性木質(zhì)素含量。

灰分測(cè)定采用LAP005規(guī)程，稱量1 g 左右已知含水率的原料，將其放入已測(cè)定質(zhì)量的有蓋陶瓷坩鍋中，置入箱式電阻爐中程序緩慢升溫，約2 h 升后至575℃，保持此溫度4 h 以上。冷至室溫前將坩鍋放入干燥器，稱量質(zhì)量并計(jì)算灰分。

1.2.2 LAT 法預(yù)處理

LAT 法預(yù)處理：根據(jù)生物質(zhì)原料與液氨的比例將確定量的液氨注入稱量小鋼瓶，將待處理的已知含水率的原料放入反應(yīng)器(高壓反應(yīng)釜)中，加熱小鋼瓶至50℃～60℃，然后將氨注入反應(yīng)器，加熱反應(yīng)器到預(yù)定溫度(約加熱10～30 min，視加熱器的功率與預(yù)定溫度而定)，然后保留一定的時(shí)間后控制在預(yù)定溫度)，而后氨被緩慢釋放(釋放時(shí)間約30 s)。取出處理后的原料置于通風(fēng)柜中室溫干燥12 h 左右或烘箱中低于45℃干燥。稱重并測(cè)得含水率，計(jì)算預(yù)處理后生物質(zhì)原料得率，將處理后的原料放入?20℃冷藏備用。

液氨預(yù)處理優(yōu)化的工藝參數(shù)選擇分別為：預(yù)處理的溫度、含水率、駐留時(shí)間以及液氨與生物質(zhì)的比例等。

1.2.3 酶水解

酶水解參照LAP009的相關(guān)規(guī)程進(jìn)行，反應(yīng)量由原來(lái)的10 mL 提高到15 mL。稱取0.15 g 葡聚糖當(dāng)量的生物質(zhì)放入酶解瓶(20 mL 樣品瓶)，預(yù)處理后的原料中葡聚糖含量視同未作預(yù)處理原料。依次加入蒸餾水、檸檬酸鈉緩沖溶液(平衡后pH 值為4.8)、抗生素(四環(huán)素和環(huán)己酰亞胺)，經(jīng)預(yù)混合1 h 后添加纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、及木糖酶(有的實(shí)驗(yàn)組未添加)。纖維素酶的添加量為15 FPU/(g 當(dāng)量葡聚糖)、β-葡萄糖苷酶64 pNPGU/g。酶解條件是溫度設(shè)定為50℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。酶解取樣時(shí)間分別為24 h、72 h 和144 h。

酶解取樣1 mL 放入離心管，放置加熱器(設(shè)置溫度99℃)中加熱20 min，使酶蛋白變性失效，放入?20℃冰箱冷卻5 min，放入離心機(jī)(艾本德5424，設(shè)置轉(zhuǎn)速14500 r/min)離心5 min，經(jīng)0.22μm 一次性針頭過(guò)濾器過(guò)濾(聚醚砜膜)后轉(zhuǎn)入HPLC 分析瓶，放入5℃或?20℃冷藏待分析。

1.2.4 單糖的測(cè)定

酶解液或酸解液中的單糖定量分析采用HPLC 法，色譜儀為Agilent Technologies 1200 Series (安捷倫公司，帶自動(dòng)進(jìn)樣器G1329A)，采用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。檢測(cè)酸解液和發(fā)酵液采用BioRad 公司的HPX-87H 色譜柱，流動(dòng)相為0.005 mol/L 稀硫酸，流速為0.60 mL/min，柱溫為50℃。

1.2.5 酶解率計(jì)算

酶解率為實(shí)際獲得單糖含量與原料中同類單糖含量之比(或同類聚糖之比)，以葡聚糖的酶解率為例，其計(jì)算公式是：

酶解率d 為百分?jǐn)?shù)，式中分子為酶解所獲得葡萄糖含量折算成葡聚糖的量，其中g(shù) 為酶解液中葡萄糖的含量(單位為g/L)；分母為理論上加入的葡聚糖量，c 為原料成分分析(酸解法)葡聚糖含量百分?jǐn)?shù)，0.375為加入酶解瓶中的干基生物質(zhì)原料質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料組分分析

表1給出了斑茅和五節(jié)芒的組分比較(原料經(jīng)95%乙醇索氏抽提24 h)。斑茅中的葡聚糖(纖維素)含量為42.88%、木聚糖含量為22.83%，兩者合計(jì)65.71%；五節(jié)芒中的葡聚糖(纖維素)含量為43.70%、木聚糖含量為22.22%，兩者合計(jì)65.92%。上述分析可知斑茅與五節(jié)芒的組分非常接近。

2.2 預(yù)處理溫度對(duì)酶解單糖得率的影響

預(yù)處理溫度對(duì)酶解率的影響如圖1所示，橫坐標(biāo)為預(yù)處理溫度(untreated 表示未經(jīng)預(yù)處理)，即預(yù)處理加熱到此溫度下并保留一定時(shí)間的溫度(實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溫度波動(dòng)范圍為±5℃)；縱坐標(biāo)為葡聚糖/木聚糖的轉(zhuǎn)化率。其他預(yù)處理?xiàng)l件為含水率80%、預(yù)處理駐留時(shí)間為10 min、液氨與原材料比例為2∶1。結(jié)果表明，在70℃～170℃范圍內(nèi)，葡聚糖的酶解轉(zhuǎn)化率隨著預(yù)處理溫度升高而增加，至130℃時(shí)達(dá)到最大值，而后隨溫度升高略有下降，130℃時(shí)72 h 取樣的酶解率為65.80%，與未經(jīng)預(yù)處理的10.31%相比提高了5.38倍。木聚糖的酶解轉(zhuǎn)化率隨溫度變化趨勢(shì)與葡聚糖相似，也在溫度為130℃時(shí)達(dá)到最高值。未經(jīng)處理原料的木聚糖轉(zhuǎn)化率為7.01%，溫度為130℃時(shí)的木聚糖轉(zhuǎn)化為81.07%，提高了10.56倍。酶解144 h 時(shí)葡聚糖和木聚糖轉(zhuǎn)化率分別為74.40%和85.44%(圖中未表示)。隨著預(yù)處理溫度的繼續(xù)提高，葡聚糖和木聚糖轉(zhuǎn)化率均無(wú)明顯變化。Murnen 等[15]采用AFEX 預(yù)處理芒(奇岡)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中72 h 葡聚糖轉(zhuǎn)化率未超過(guò)70%，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果的轉(zhuǎn)化率略高。國(guó)外學(xué)者以玉米秸稈為原料，采用ARP 法預(yù)處理，纖維素酶的添加量為每克葡聚糖15 FPU/(g 當(dāng)量葡聚糖)，72 h 的葡聚糖轉(zhuǎn)化率為88.5%[9]。經(jīng)對(duì)LAT 法預(yù)處理后的木質(zhì)素含量分析，130℃實(shí)驗(yàn)條件下預(yù)處理后原料的酸不溶性木質(zhì)素比未經(jīng)預(yù)處理的原料下降13.75%，這是酶解效果提高的一個(gè)原因。Rollin 等研究認(rèn)為提高纖維素的可及性比移除木質(zhì)素更為重要[20]，表面結(jié)構(gòu)與纖維素結(jié)晶度改變情況有待進(jìn)一步研究。

2.3 預(yù)處理含水率控制對(duì)酶解單糖得率的影響

預(yù)處理前原料的含水率對(duì)預(yù)處理效果有一定的影響，實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加水來(lái)控制原料預(yù)處理時(shí)的含水率。將溫度控制在優(yōu)化溫度130℃，原料含水率對(duì)酶解率的影響如圖2所示，實(shí)驗(yàn)中的含水率為水分與干基物料比值。結(jié)果表明，隨著含水率升高，轉(zhuǎn)化率上升，當(dāng)含水率為80%～100%時(shí)，葡聚糖的酶解轉(zhuǎn)化率較高，72 h 取樣的酶解率分別為69.34%和71.04%(因預(yù)處理批量與酶解批量不同，相同預(yù)處理?xiàng)l件下，酶解率略有差異)，與未經(jīng)預(yù)處理的10.31%相比分別提高了573%和1056%。未經(jīng)處理的木聚糖轉(zhuǎn)化率為7.01%，經(jīng)LAT 預(yù)處理后木聚糖轉(zhuǎn)化率顯著提高，在含水率控制為80%時(shí)為82.60%，木聚糖轉(zhuǎn)化率比未經(jīng)預(yù)處理的提高了10.78倍。實(shí)驗(yàn)顯示預(yù)處理的含水率控制為80%，酶解144 h 時(shí)，葡聚糖和木聚糖的酶解率分別為73.98%和83.39%。

表1 生物質(zhì)的組分分析(干基)Table 1 Compositional analysis (dry basis) of biomass

圖1 不同溫度下斑茅中葡聚糖/木聚糖的酶解轉(zhuǎn)化率Fig.1 Effects of temperature on glucan and xylan conversion of LAT treated Saccharum arundinaceum.The treatment condition (fixed) was at 80% moisture content (dwb),2:1 ammonia loading and 10 min residence time.The cellulase loading was 15 FPU/(g of glucan),and the enzymatic hydrolysis time was 24 h and 72 h.

圖2 不同含水率下斑茅中葡聚糖/木聚糖的酶解轉(zhuǎn)化率Fig.2 Effects of moisture content on glucan and xylan conversion of LAT treated Saccharum arundinaceum.The treated condition (fixed) was at 130℃,2:1 ammonia loading and 10 min residence time.The Cellulase loading was 15 FPU/(g of glucan),and the enzymatic hydrolysis time was 24 h and 72 h.

2.4 駐留時(shí)間對(duì)酶解單糖得率的影響

將溫度控制在130℃、含水率為80%、液氨與原料比例為2∶1時(shí)，以駐留時(shí)間分別為5 min、10 min、15 min 對(duì)照試驗(yàn)，對(duì)酶解率的影響如圖3所示。在10 min 內(nèi)，酶解率隨著預(yù)處理駐留時(shí)間增加而提升，而預(yù)處理時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，酶解率下降。10 min 左右對(duì)葡聚糖和木聚糖均有較好的酶解轉(zhuǎn)化率，分別為69.34%和82.60%。隨著預(yù)處理時(shí)間加長(zhǎng)，可能是聚糖或單糖分解導(dǎo)致酶解率下降，葡萄糖得率下降較緩慢，而木糖得率快速下降。

圖3 不同駐留時(shí)間下斑茅中葡聚糖/木聚糖的酶解轉(zhuǎn)化率Fig.3 Effects of residence time on glucan and xylan conversion of LAT treated Saccharum arundinaceum.The treated condition (fixed) was at 130℃,80%moisture content and 2:1 ammonia loading.The cellulase loading was 15 FPU/(g of glucan),and the enzymatic hydrolysis time was 24 h and 72 h.

2.5 液氨和生物質(zhì)比例對(duì)酶解單糖得率的影響

將優(yōu)化后的因素(130℃、80%含水率、10 min)液氨與生物質(zhì)比例(干基)按照質(zhì)量比0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)液氨比例升高時(shí)，葡聚糖轉(zhuǎn)化率上升，2∶1以上增加趨緩；木聚糖的酶解轉(zhuǎn)化率在2∶1時(shí)達(dá)到最高值，隨著氨用量提高，木糖得率下降明顯。文獻(xiàn)指出農(nóng)作物秸稈類原料最佳氨用量比例為1∶1[11-14]，斑茅與之不同，結(jié)果顯示優(yōu)化條件與生物質(zhì)種類有顯著的相關(guān)性。

2.6 質(zhì)量平衡與預(yù)處理效果比較

預(yù)處理與酶解的質(zhì)量平衡流程如圖5所示。在前述預(yù)處理優(yōu)化條件(預(yù)處理溫度130℃、含水率80%、駐留時(shí)間為10 min、液氨與生物質(zhì)比例為2∶1)，纖維素酶添加量為15 FPU/(g 當(dāng)量葡聚糖)，100 g 干基斑茅經(jīng)72 h 酶解后可獲得單糖54.47 g，而未作預(yù)處理的單糖獲得量為6.73 g，轉(zhuǎn)化率提高了8.09倍。Vanderghem 等采用甲酸/乙酸混合液對(duì)芒草在107℃處理3 h，其最高酶解轉(zhuǎn)化率達(dá)75.3%[21]，酶解效果與LAT 法相近。Sorensen 等采用稀酸預(yù)浸/濕爆法對(duì)芒草進(jìn)行預(yù)處理[22]，預(yù)處理后的芒酶解的葡萄糖、木聚糖的最高得率分別為63.7%和82.4%。本試驗(yàn)的LAT法預(yù)處理斑茅的酶解得率為69.34%和82.65%，說(shuō)明LAT 法預(yù)處理對(duì)斑茅的酶解促進(jìn)效果更好。

圖4 液氨與生物質(zhì)不同比例下斑茅中葡聚糖/木聚糖的酶解轉(zhuǎn)化率Fig.4 Effects of ammonia loading on glucan and xylan conversion of LAT treated Saccharum arundinaceum.The treated condition (fixed) was at 130℃,80%moisture content and 10 min residence time.The cellulase loading was 15 FPU/(g of glucan),and the enzymatic hydrolysis time was 24 h and 72 h.

圖5 斑茅液氨預(yù)處理與酶解過(guò)程質(zhì)量平衡流程圖Fig.5 Flow chart of mass balance during pretreatment and hydrolysis process for Saccharum arundinaceum.The LAT pretreatment condition was at 130℃,80% moisture content,2:1 ammonia loading and 10 min residence time.The cellulase loading was 15 FPU/(g of glucan),and the enzymatic hydrolysis time was 24 h and 72 h.

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)斑茅的LAT 法預(yù)處理、酶解過(guò)程的試驗(yàn)研究，得到如下結(jié)論。斑茅與芒在化學(xué)組分上比較接近，其預(yù)處理效果與芒有較大的可比性。液氨預(yù)處理能顯著提高斑茅原料的單糖轉(zhuǎn)化率，通過(guò)優(yōu)化預(yù)處理?xiàng)l件比未經(jīng)預(yù)處理的原料的單糖獲得量提高到8倍。預(yù)處理效果優(yōu)于稀酸預(yù)浸/濕爆法，與酸預(yù)處理、氨爆法(AFEX)處理效果接近。

斑茅采用LAT 法預(yù)處理的優(yōu)化條件是：溫度為130℃、含水率80%、駐留時(shí)間為10 min、液氨與生物質(zhì)比例為2∶1時(shí)，在纖維素酶添加量為15 FPU/(g 當(dāng)量葡聚糖)時(shí)，葡萄糖和木糖的72 h 酶解轉(zhuǎn)化率分別為69.34%和82.65%，相比于未作預(yù)處理的原料分別提高了573%和1056%，預(yù)處理顯著地提升了酶解效率。

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