三例小麥細胞質雄性不育系線粒體DNA的擴增片段長度多態(tài)性分析

朱啟迪，張新缽，Ejaz M，張改生，車會學，王書平，宋齊魯，楊書玲，張龍雨

西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100

細胞質雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)普遍存在于高等植物中，是生產上廣泛利用農作物雜種優(yōu)勢的基礎。小麥作為世界第一大糧食作物，對其雜種優(yōu)勢利用的研究，特別是雄性不育機理的研究，一直是眾多雜交小麥研究者設法攻克的科學難關[1-2]。大量的研究表明，植物雄性不育不僅與葉綠體相關[3-6]，而且與線粒體的關系更加密切相關[7-9]。目前在小麥[10]、水稻[11]、豌豆[12]等植物中已經鑒定出與細胞質雄性不育相關的mtDNA 片段。人們普遍認為，植物細胞質雄性不育與mtDNA 的重排、插入、缺失所產生的突變有關，這些突變能夠產生可表達的開放閱讀框架，從而使mtDNA 轉錄和翻譯的產物發(fā)生變化，導致植物雄性不育的產生[13-16]。韓艷芬等[17]對黏類小麥細胞質雄性不育線粒體atp6基因轉錄本編輯位點研究，編輯不充分的轉錄產物會影響線粒體功能的正常發(fā)揮，進而影響到受體雄性不育的產生；李文強等[18]利用分子標記技術對小麥質核互作型雄性不育系mtDNA 的變異性進行了RAPD 分析，表明小麥線粒體基因組的變異性很可能涉及到不育系育性本質的改變，同時認為研究小麥細胞核相同而細胞質來源不同的不育系間mtDNA 的差異，對進一步探尋小麥細胞質雄性不育機理，尤其是用于區(qū)分鑒定不同不育胞質類型具有十分重要的理論和實踐意義。然而，在細胞質雄性不育中由于存在核質互作現象，很難確定細胞質基因組的差異是由細胞質基因組本身引起的，還是由于細胞核通過對細胞質的互作影響而產生的，因此如果不經過選擇專門的研究材料，僅單一地對某一供試材料進行研究很難確定其不育胞質來源與性質。為了解決這一問題，本研究經過多年的實踐培育出一批異質同核小麥不育材料，這些材料均通過連續(xù)回交轉育數十代，它們具有相同的核遺傳背景。用這些材料為供試材料，在對雄性不育研究過程中可以完全排除供試材料間因細胞核差異帶來的影響，得到的差異可以認為是來自于細胞質基因組的本質差異。本研究正是基于此，選取3例異質同核小麥雄性不育系及其對應保持系為材料，利用擴增片段長度多態(tài)性標記技術對其mtDNA 進行差異性分析，旨在小麥雜種優(yōu)勢利用中在分子水平上分析鑒別不同不育細胞質類型以及各個不同不育細胞質育性的特異性，以提高核質互作型不育類型的實際利用效能。

1 材料與方法

1.1 材料及材料處理

供試3例異質同核小麥雄性不育材料是經多年采用普通小麥Triticum aestivum 同一親本(A)90-110回交轉育而成的小麥不育系，其回交世代均在15代以上，因此它們的核基因型相當一致。分別為：具有粘果山羊草Aegilops kotschyi 不育細胞質型的ms (Kots)-90-110不育系、偏凸山羊草Ae.ventricosa 細胞質型的ms (Ven)-90-110不育系、普通小麥變種斯卑爾脫Triticum spelta 細胞質型的ms (S)-90-110不育系。以上材料均由西北農林科技大學陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點實驗室提供與保存。

小麥黃化苗的培育：分別取4份供試材料種子，用蒸餾水沖洗干凈。去除癟粒后，用無菌水沖洗3～4次。將種子浸泡于無菌水中24 h，中間換水1次；再將種子鋪于干凈無菌的兩層濾紙上，置于30℃暗室中催芽24 h，然后調節(jié)溫度降至28℃培養(yǎng)10 d 左右，每天換蒸餾水2次；等到黃化苗約15 cm 高時停止培養(yǎng)，用20%次氯酸鈉滅菌后，再用無菌水漂洗2次，剪成1 cm 左右的小段備用。

1.2 線粒體的提取和純化

線粒體及mtDNA 提取的具體操作步驟主要參照文獻[19-20]并加以改進，以下操作未經特別說明均在4℃或者冰浴中進行。

黃化苗材料10 mL/g 加入勻漿液(500 mmol/L 甘露醇，50 mmol/L Tris-HCl pH 7.6，20 mmol/L EDTA，0.2% BSA，0.2%β-巰基乙醇)，勻漿后通過4層紗布過濾。濾液3000×g、4℃離心10 min 得上清液，然后上清液18000×g、4℃離心30 min 得沉淀；沉淀溶解于勻漿液。重復上述過程得到的沉淀即為粗線粒體。

將獲得的線粒體沉淀再次懸于10 mL 懸浮液A(500 mmol/L 甘露醇，50 mmol/L Tris-HCl)，加過量DNaseⅠ以除去核DNA 及破碎mtDNA，混勻后在冰上放置1 h，加入EDTA 到上述懸浮液中停止DNaseⅠ的消化反應。然后再加4倍體積的懸浮液B (500 mmol/L 甘露醇，50 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA)稀釋DNaseⅠ消化后的線粒體懸浮液，4℃、18000×g 離心懸浮液30 min，將上清倒掉，然后加入5 mL 懸浮液B用軟毛筆懸浮線粒體沉淀。

配制蔗糖梯度溶液，它們的濃度分別為：0.6 mol/L、1.2 mol/L、1.6 mol/L。將上述粗制線粒體懸浮液平均鋪于不連續(xù)的蔗糖梯度溶液斜面上，50000×g、4℃離心90 min。收集1.2～1.6 mol/L 界面部分，溶于5倍體積懸浮液B，然后30000×g、4℃離心30 min，沉淀即為純化的完整線粒體。

1.3 線粒體裂解及DNA 純化

線粒體裂解及DNA 純化方法主要參照李文強[18]的方法并加以改進。線粒體沉淀中加入1 mL 裂解緩沖液(25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20 mmol/L EDTA，pH 8.0，0.5% SDS)，然后加入蛋白酶K (Meck)至終濃度為100μg/mL，重新懸浮沉淀。首先50℃水浴1 h，之后再37℃水浴1 h，水浴期間每隔一段時間輕輕搖動1次。裂解結束后加入2 mol/L 醋酸銨溶液100μL，混勻，加入800μL TE 飽和酚/氯仿(1∶1)，再次混勻并靜置10 min，18000×g 離心5 min，吸取上清，重復抽提1次。將上清液分裝于1.5 mL 離心管中，加入2倍體積的無水乙醇并混勻，?70℃靜置1 h，18000×g 離心15 min，所得白色沉淀干燥后加入30μL TE 溶液(含有20μg/L RNase)，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小麥mtDNA 的質量和純度檢測

1.4.1 mtDNA 質量檢測

用紫外分光光度計分別測定 mtDNA 在260 nm、280 nm、230 nm 的OD 值，并計算出A260/A280、A260/A230值，進行純度分析。

1.4.2 mtDNA 純度鑒定

以mtDNA 為模版，分別利用細胞核基因組上肌動蛋白β亞基(β-actin)基因和線粒體基因組上細胞色素C 氧化酶第三亞基(COXIII)基因內參標記進行PCR 擴增，在1.0%的瓊脂糖凝膠100 V 的電壓電泳40 min 后觀察效果，檢測所提取的mtDNA 質量。

1.5 mtDNA 的AFLP 分析

1.5.1 模板DNA 制備

雙酶切目的DNA：選用EcoRⅠ/MseⅠ兩種酶。反應混合液按表1配制。先在37℃溫浴3 h，再在65℃溫浴2.5 h，有條件時可以在酶切過程中用另一臺PCR 儀進行接頭的復性。復性的熱循環(huán)條件為：65℃10 min，37℃10 min，25℃10 min，42℃5 min。

DNA 片段的連接：用T4 DNA 連接酶，將混合液加入等體積酶切混合物，16℃或22℃室溫下放置過夜。

1.5.2 AFLP 引物的選擇

采用的AFLP 引物由北京六合華大科技有限公司合成，其引物組成見表2，選擴引物共64對組合，如表3所示。

1.5.3 預擴增反應

按照表4建立PCR 預擴體系(20μL)，混勻后離心10 s，PCR 預擴程序26個循環(huán)為：94℃30 s，56℃45 s，72℃1 min ，4℃保存。擴增后，反應混合物稀釋50倍，稀釋好的產物和剩下的產物一起置?20℃貯存，稀釋好的產物作為下一步擴增反應的模板。

1.5.4 選擇性擴增

選擇性擴增PCR 程序為：第1個循環(huán)是：94℃30 s，65℃30 s，72℃1 min ，第2～13個循環(huán)，DNA 退火溫度每次遞減0.7℃，第14～36循環(huán)，退火溫度是56℃，其余步驟同第一個循環(huán)，選擴體系見表5。反應結束后，擴增產物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，硝酸銀染色。

表1 AFLP 限制性酶切體系Table 1 AFLP restriction enzyme digestion system

表2 EcoRⅠ引物和MseⅠ引物的組成Table 2 Component of primers EcoRⅠand MseⅠ

表3 EcoRⅠ-MseⅠ及其相關引物組合Table 3 Primers combinations of EcoRⅠand MseⅠ

表4 AFLP 預擴增PCR 反應體系Table 4 PCR reaction system of AFLP pre-amplification

表5 AFLP 選擇性擴增PCR 反應體系Table 5 PCR reaction system of AFLP selective amplification

2 結果與分析

2.1 不連續(xù)蔗糖梯度結果

粗制線粒體懸浮液經不連續(xù)蔗糖梯度離心后會形成3個不同的界面，吸取1.2～1.6 mol/L界面部分即為所要的線粒體，如圖1所示。

2.2 mtDNA 的質量檢測

將獲得的mtDNA 用TE 溶液溶解后進行分光光度測定，其A260/A280值介于1.8～2.0，表明樣品中無蛋白質或者酚類污染，A260/A230值在2.0～2.1之間，表面樣品中沒有糖類或者有機試劑污染。在提取mtDNA 過程中，若不用DNaseⅠ處理，得到的mtDNA 經瓊脂糖凝膠電泳檢測后可以看出條帶有明顯的拖尾。使用DNaseⅠ處理后，拖尾現象消失，可見一條清晰的mtDNA 條帶，帶型整齊(圖2)，表明利用該方法提取的mtDNA 質量良好。

圖1 不連續(xù)蔗糖梯度結果Fig.1 Result of discontinuous sucrose gradient.

圖2 加入DNaseⅠ的mtDNA 檢測結果Fig.2 Results of mtDNA with DNase Ⅰ.(A)(A)-90-110.(B) ms(Kots)-90-110.(C) ms(Ven)-90-110.(D) ms(S)-90-110.

2.3 內參基因對mtDNA 的鑒定

提取高純度的mtDNA 是利用分子手段研究線粒體的前提。利用差速離心去掉細胞核、質體及碎片，DNaseⅠ可以酶切掉破裂的細胞核DNA、mtDNA 以及質體DNA。不連續(xù)蔗糖梯度離心對線粒體進一步純化，能排除其他基因組DNA 的污染。分別利用細胞核基因組上肌動蛋白β亞基(β-actin)基因和線粒體基因組上細胞色素C 氧化酶第3亞基(COXIII)基因的特異性引物，以mtDNA 為模板進行PCR 擴增，所得產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3)。結果發(fā)現線粒體基因COXIII 的特異性引物在mtDNA 中能擴增出一條預期大小(約400 bp)的DNA 條帶，而細胞核基因β-actin 的特異性引物卻沒有擴增出其特異性條帶，從而表明利用本方法提取的mtDNA 純度很好，沒有受到細胞核DNA 的污染。

2.4 mtDNA 的AFLP 分析

圖3 內參基因對mtDNA 的PCR 檢測結果Fig.3 Results of internal reference gene amplified in mtDNA.M:marker(DL2000).1:β-Actin gene.2:COXIII gene.

采用64對引物組合檢測了供試材料3例異質同核小麥雄性不育系及其保持系mtDNA 之間的差異，將所提取的mtDNA 經EcoRⅠ、MseⅠ雙酶切，預擴增和選擇性擴增，聚丙烯酰胺凝膠電泳可以得到幾十條清晰的亮帶。從64對引物組合中共篩選出4對引物E1/M7、E4/M2、E6/M4、E7/M6擴增結果表現差異。

從圖4中可以看出，在引物E1/M7擴增條件下，ms (Kots)-90-110不育系擴增出200 bp 左右、400 bp 左右、750 bp 左右3條特異條帶，而ms (S)-90-110不育系擴增出一條500 bp 左右特異條帶，從而可以鑒定具有粘果山羊草Aegilops kotschyi 不育質型和斯卑爾脫Triticum spelta 不育質型的 mtDNA。引物 E4/M2在粘果山羊草Aegilops kotschyi 不育質型的ms (Kots)-90-110不育系擴增出一條200 bp 左右特異條帶，而在偏凸山羊草 Ae.ventricosa 不育質型的 ms(Ven)-90-110不育系擴增出600 bp 左右、1000 bp左右兩條特異條帶，從而可以鑒定這兩種不育系的mtDNA。從圖5中可以看出，在引物E7/M6擴增條件下，只有斯卑爾脫Triticum spelta 不育質型的ms (S)-90-110不育系在300 bp 左右、400 bp 左右的位置擴增了兩條特異條帶，從而可以鑒定具斯卑爾脫Triticum spelta 不育質型的ms(S)-90-110的mtDNA。引物E6/M4只在具粘果山羊草 Aegilops kotschyi 不育質型的 ms(Kots)-90-110不育系擴增出200 bp 左右、250 bp左右兩條特異條帶，可以用來鑒定該類型不育系的mtDNA。因此，實踐中上述4對特異引物可以作為鑒定粘果山羊草Aegilops kotschyi、偏凸山羊草Ae.ventricosa、斯卑爾脫Triticum spelta這3類不育細胞質類型的細胞質分子標記。

圖4 三個不育系及保持性AFLP 擴增圖譜Fig.4 AFLP amplification profiles of three CMS lines and the maintainer line.(A)(A)-90-110.(B) ms(Kots)-90-110.(C) ms (Ven)-90-110.(D) ms (S)-90-110.1?4:primer E1/M7;5?8:primer E4/M2.

圖5 三個不育系及保持性AFLP 擴增圖譜Fig.5 AFLP amplification profiles of three CMS lines and the maintainer line.(A) ms (S)-90-110.(B) ms(Ven)-90-110.(C) ms (Kots)-90-110.(D)(A)-90-110.1?4:primer E7/M6;5?8:primer E6/M4.

3 討論

本研究以小麥黃化苗為實驗材料，由于黃化苗生長周期較短(7～10 d)，種子自身營養(yǎng)就能夠滿足其生長需要，因此培養(yǎng)基質用無菌水即可。黃化苗培養(yǎng)過程中要嚴格進行避光處理，否則極易出現返綠現象，提取的mtDNA 受到葉綠體DNA 的污染，因此換水時間一般在黑暗環(huán)境中進行。黃化苗最好在30℃左右的溫度下培養(yǎng)，這樣不僅幼嫩的植物組織更容易破碎，有利于mtDNA 的提取，而且在較高溫度下細胞代謝旺盛，形成的線粒體更多，大大提高了線粒體mtDNA 的產率。

在提取小麥mtDNA 過程中對儀器設備的要求比較高，需要轉速50000×g 以上的高速冷凍離心機。為了降低試驗成本，用蔗糖梯度離心法代替Percoll 密度梯度離心法[21]，一方面蔗糖是目前發(fā)現的成本最低的密度梯度離心介質，另一方面蔗糖在密度大于1.1 g/mL (質量分數為25%)和低溫條件下，它的黏度較高和擴散較慢，雖然不利于連續(xù)梯度的形成，但是有利于制備不連續(xù)梯度，還可以防止由于顆粒擴散而造成的區(qū)帶變寬。制備好穩(wěn)定的梯度后，在加樣和離心過程中需要特別小心，防止梯度遭到破壞，如果梯度遭到破壞，離心后線粒體就會沉淀到離心管底部，不能獲取高質量的mtDNA。

mtDNA 是植物細胞質雄性不育相關基因的載體。不育系線粒體基因組中某些位點經分子內或分子間重排產生了不同于保持系mtDNA 的特異位點，這些位點是產生細胞質雄性不育的分子基礎[22]。而利用分子標記技術比較不育系與保持系mtDNA 結構的差異，可以進一步鑒定出與細胞質雄性不育相關特異性的線粒體基因。對小麥異質同核雄性不育材料進行分子標記以前多采用RAPD 標記，高春保等[23]利用RAPD 分子標記技術對幾類異質同核小麥雄性不育系進行遺傳多樣性分析，篩選出3條特異引物，但是此標記方法容易受外界環(huán)境影響，重復性比較差。而AFLP 分子標記重復性、穩(wěn)定性均很好，因此對異質同核小麥材料進行AFLP 標記，結果更加可靠穩(wěn)定。本文正是基于此，采用3例異質同核小麥雄性不育系及其共同保持系為材料，篩選出了4對特異引物在3例異質同核小麥雄性不育系及其共同保持系中均表現出了穩(wěn)定的差異，且這些差異能夠作為一個穩(wěn)定分子標記在實踐中用以區(qū)分鑒別K、Ven、S 型小麥不育胞質類型。一般情況下，“雄性不育(CMS)-育性恢復”都是核質互作的產物，常作為一個整體考慮[24]，不注意特別選材，所獲差異較難明晰歸屬于細胞質還是細胞核。而本文供試的3例異質同核小麥雄性不育材料是經多年采用同一親本(A)90-110回交轉育而成的小麥不育系，其回交世代均在15代以上，它們的核基因型相當一致；采用這些材料為供試材料，在雄性不育研究過程中完全可排除供試材料間因細胞核差異帶來的影響，得到的差異完全可認為是來自細胞質基因組的本質差異。本研究后續(xù)實驗還將擴大到同質異核材料間的研究，這樣就可以從縱橫關系來探討細胞質分子標記的方法與途徑。特別是將上述特異分子標記所顯示的特異條帶進行克隆、測序與表達，這將為進一步發(fā)現和挖掘新的小麥細胞質雄性不育相關基因及特異分子標記提供技術支撐，同時也為更深入地研究細胞質雄性不育機理奠定堅實的基礎。

4 結論

利用差速離心法和不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法提取純化的小麥線粒體，其質量和純度能夠滿足PCR 反應和遺傳性分析。對3例異質同核的小麥雄性不育系即具粘果山羊草Aegilops kotschyi 不育細胞質型的ms (Kots)-90-110不育系、偏凸山羊草Ae.ventricosa 不育細胞質型的ms (Ven)-90-110不育系、普通小麥變種斯卑爾脫Triticum spelta 不育細胞質型的ms(S)-90-110不育系以及共同保持系(A)90-110的mtDNA 進行AFLP 分析，表現出穩(wěn)定的差異，篩選出的4對特異引物，可以用來作為鑒定這幾類小麥細胞質雄性不育系的細胞質分子標記，為區(qū)分不同小麥細胞質不育系提供了一定的理論和技術支撐，也為進一步研究其不育特異性及其細胞質種性奠定了分子基礎。

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