HPLC法測(cè)定婦科調(diào)經(jīng)顆粒中阿魏酸的含量

劉冰松 袁昕蓉

（1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110101；2 沈陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110013）

HPLC法測(cè)定婦科調(diào)經(jīng)顆粒中阿魏酸的含量

劉冰松1袁昕蓉2

（1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110101；2 沈陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110013）

目的 采用 HPLC 法測(cè)定婦科調(diào)經(jīng)顆粒中阿魏酸的含量。方法 采用 Diamonsil C18 （200mm×4.6mm，5μm）色譜柱，以甲醇 -0.1%磷酸水溶液（30 ∶ 70）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng) 320nm。結(jié)果 阿魏酸進(jìn)樣量在 0.0104 ～ 0.1040μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999），加樣回收率為 98.89%，RSD 為 1.05%。結(jié)論 本方法準(zhǔn)確靈敏，重復(fù)性好，可用于婦科調(diào)經(jīng)顆粒中阿魏酸的含量測(cè)定。

阿魏酸；婦科調(diào)經(jīng)顆粒；高效液相色譜法

婦科調(diào)經(jīng)顆粒為2005年版中國(guó)藥典收載品種。處方由當(dāng)歸、川芎、香附、白芍、赤芍、熟地等10味藥材組成，具有養(yǎng)血，調(diào)經(jīng)，止痛的功效，用于治療月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)期腹痛。原標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定指標(biāo)為芍藥苷。由于當(dāng)歸為方中主藥，有必要對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。而且藥典同期收載的婦科調(diào)經(jīng)片的含量測(cè)定指標(biāo)也是阿魏酸。所以我們選取了當(dāng)歸中的有效成分阿魏酸作為含量測(cè)定的指標(biāo)。由于方中另一味藥材川芎中也含有阿魏酸，所以本含量測(cè)定項(xiàng)是測(cè)定其中的當(dāng)歸和川芎兩味藥材中的阿魏酸。我們?cè)趨⒖加嘘P(guān)文獻(xiàn)[1,2]的基礎(chǔ)上，制定了婦科調(diào)經(jīng)顆粒有效成分—阿魏酸的含量測(cè)定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明該方法靈敏、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于該制劑中阿魏酸的含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

島津LC-10A液相色譜儀，SPD-10A vp Plus檢測(cè)器，N2000色譜工作站；TB-114 電子分析天平（丹佛）；阿魏酸對(duì)照品（含量測(cè)定用，中檢所，批號(hào)：0773-9910），婦科調(diào)經(jīng)顆粒（自制，批號(hào)：20081101、20081102、20081103）；甲醇為色譜純，水為重蒸水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

精密稱取阿魏酸對(duì)照品適量，加甲醇稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?，?90～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。掃描結(jié)果顯示：在320nm波長(zhǎng)處，阿魏酸有最大吸收，故選擇320nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil C18 （200mm×4.6mm，5μm）流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（30∶70）；檢測(cè)波長(zhǎng)：320nm；流速：1mL/ min；理論板數(shù)以阿魏酸色譜峰計(jì)不低于5000。

2.3 專屬性試驗(yàn)

2.3.1 對(duì)照品溶液制備：取阿魏酸對(duì)照品適量，制成每1mL約含2.5μg阿魏酸的甲醇溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液制備：取本品細(xì)粉約5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶里，精密加甲醇20mL，稱量，超聲處理（功率160W，頻率50kHz）20min，放冷，再稱重，加甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.3 陰性對(duì)照液制備：按工藝制備不含有當(dāng)歸與川芎的陰性顆粒，取細(xì)粉適量，照上述方法制備陰性對(duì)照液。

2.3.4 取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性液各20μL，分別進(jìn)樣，結(jié)果顯示，處方中其他藥材及輔料不干擾阿魏酸的檢出（圖1）。

2.4 線性范圍

精密稱取阿魏酸對(duì)照品10.40mg，置100mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度。分別精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0mL上述溶液，置100mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度。分別吸取20μL注入色譜儀中，測(cè)定峰面積。將進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=5459812.0x+1306.5 r=0.9999。結(jié)果表明：阿魏酸的進(jìn)樣量在0.0104～0.1040μg范圍內(nèi)時(shí)，其線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取阿魏酸對(duì)照品溶液（濃度2.5μg/mL）20μL，連續(xù)進(jìn)樣6針，照上述色譜條件分析，測(cè)定峰面積，RSD為0.65%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取供試品溶液20 μL，分別在0、2、4、6、8、10h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，RSD為0.95%，說(shuō)明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取一批婦科調(diào)經(jīng)顆粒（批號(hào)：20081101），制備6份供試品溶液，測(cè)定出樣品中的阿魏酸含量為11.51μg/g，RSD為1.03%，符合規(guī)定。

2.8 加樣回收率

精密稱取樣品（批號(hào)：20081101）細(xì)粉6份，每份約2.5g，每份精密加入對(duì)照品溶液2.5mL（10.40μg/mL），照供試品溶液制備方法操作，進(jìn)樣20μL，測(cè)定其加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，按上述方法測(cè)定每批樣品的阿魏酸含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

文中加樣回收率的問(wèn)題，取同一濃度的供試品，用六個(gè)測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)的方法是可行的。根據(jù)：中國(guó)藥典2010版一部附錄P130《中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》中指出，取同一濃度的供試品，用6個(gè)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，或設(shè)計(jì)3個(gè)不同濃度，用9個(gè)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。說(shuō)明我文中的驗(yàn)證方法和專家所提的按3個(gè)量級(jí)加入的方法都是正確的。因此沒(méi)有修改。在中藥新藥研制中，用6個(gè)結(jié)果評(píng)價(jià)的方法更常用，化藥是必須要用9個(gè)結(jié)果評(píng)價(jià)的。

圖1 HPLC 色譜圖

表1 阿魏酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 三批樣品含量測(cè)定結(jié)果

回收率表中“樣品中的量”，個(gè)人認(rèn)為其數(shù)值應(yīng)該是取樣量乘以已知含量，即所取的樣品中總共含有多少目標(biāo)待測(cè)物。如果按專家的意見(jiàn)換算成μg，其實(shí)上是進(jìn)樣體積的樣品溶液中含有多少目標(biāo)待測(cè)物，表1的第一列為“取樣量”，如果在第二列的“樣品中的量”給出的是進(jìn)樣的量的話，容易引起誤解。同理，“加入量”、“測(cè)得量”也應(yīng)該是總量，而非進(jìn)樣量。至于說(shuō)“測(cè)得量應(yīng)在線性范圍內(nèi)”應(yīng)該指進(jìn)樣體積乘以進(jìn)樣濃度的乘積即進(jìn)樣量在線性范圍內(nèi)。我們?cè)谛滤幧陥?bào)資料中一般按文中的方法進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)并進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，沒(méi)有遇到過(guò)問(wèn)題。在此，作者保留個(gè)人看法，但尊重專家和編輯的意見(jiàn)，將回收率表的第二、三、四列的數(shù)據(jù)換算成進(jìn)樣質(zhì)量。

3 討 論

進(jìn)行色譜條件篩選時(shí)，曾經(jīng)對(duì)乙腈-0.085%磷酸水溶液（17∶83）[1]，乙腈-0.3%乙酸水溶液（30∶70），甲醇-0.1%磷酸水溶液（30∶70）等不同流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，以甲醇-0.1%磷酸水溶液（30∶70）作為流動(dòng)相時(shí)，分離效果較好[2]，峰形對(duì)稱，保留時(shí)間適當(dāng)，作為婦科調(diào)經(jīng)顆粒中阿魏酸的含量測(cè)定方法可行。

[1]國(guó)家藥典藥典委員會(huì).中華人民 共和國(guó)藥典(一 部 )[M].北京:化 學(xué)工業(yè)出版社,2005:461.

[2]蔣心惠,張丹.RP-HPLC法測(cè)定普藏紅膠囊中阿魏酸的含量[J].華西藥學(xué)雜志,2001,16(4):374-375.

R927.2

：B

：1671-8194（2013）10-0070-03