丹紅注射液對腦缺血再灌注后凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）表達及神經(jīng)元凋亡的影響

羅德云

（攸縣中醫(yī)院，湖南 株洲 412300）

丹紅注射液對腦缺血再灌注后凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）表達及神經(jīng)元凋亡的影響

羅德云

（攸縣中醫(yī)院，湖南 株洲 412300）

目的 探究丹紅注射液對腦缺血再灌注后凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）表達及神經(jīng)元凋亡的影響。方法 將21只Wistar大鼠隨機分成三組：甲、乙、丙，其中甲組為假手術(shù)組，乙組為局灶性腦缺血再灌注組，丙組則為丹紅注射液治療組，之后采用改良線栓法來建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，甲乙丙三組都在1、3、5d之后對大鼠腦組織進行AIF及神經(jīng)元凋亡變化的測定。結(jié)果 丙組大鼠腦組織AIF及神經(jīng)元的凋亡在造模后的1、3、5d都明顯要低于甲乙組（P＜0.05），可見差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 本研究顯示，利用丹紅注射液能有效抑制AIF的表達，從而減少神經(jīng)元的凋亡，由此可見其對于大鼠腦缺血再灌注有著積極的保護作用。

丹紅注射液；腦缺血再灌注；凋亡誘導(dǎo)因子；AIF；神經(jīng)元凋亡

目前，嚴重危害人類健康的疾病中有一種缺血性腦血管病，而腦缺血損傷病理生理過程十分復(fù)雜，當前依然在不斷探索之中[1]。隨著科技不斷進步，再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡已普遍受到了廣泛關(guān)注，而如何減少再灌注損傷也成為了治療急性缺血性卒中的重要工作。本研究以Wistar大鼠作為研究對象，進行了丹紅注射液對腦缺血再灌注后凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）表達及神經(jīng)元凋亡的影響的研究，取得了良好的效果?，F(xiàn)將相關(guān)結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 資本資料

實驗動物：21只Wistar大鼠，體質(zhì)量在250～330g，平均為275.9g；年齡在3～4個月間，平均為3.4個月。全部由我省總醫(yī)院實驗動物中心所提供，大鼠之間的一般資料差異性不大，因此具有可比性。藥物與試劑：丹紅注射液、AIF兔多克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒、TUNEL凋亡檢測試劑盒。

1.2 基本方法

隨機將21只Wistar大鼠隨機分成三組：甲、乙、丙，其中甲組為假手術(shù)組，乙組為局灶性腦缺血再灌注組，丙組則為丹紅注射液治療組。丙組給予丹紅注射液5mL/kg，在手術(shù)之前30min進行腹腔注射，每日進行一次，連續(xù)注射5d。乙組則給予等量的生理鹽水。

1.3 動物建模

模型制作參照Nagasawa等[2]的改良線栓法制成大鼠大腦中動脈缺血模型。采用水合氯醛腹腔對大鼠進行注射麻醉，將其采用仰臥固定，分離其右側(cè)的頸總動脈、頸內(nèi)動脈與頸外動脈，同時將其頸總動脈與頸外動脈結(jié)扎，利用動脈夾夾閉頸總動脈，迅速在頸內(nèi)動脈和頸外動脈分叉的下方剪一個切口，利用預(yù)先燒成圓頭的尼龍線插入頸內(nèi)動脈（深度控制在18.55毫米左右），當有輕微阻力感，便可實現(xiàn)大腦中動脈阻塞以此形成腦缺血。之后，做好相關(guān)后續(xù)工作，比如結(jié)扎與縫合等。

1.4 AIF免疫組化標記

AIF免疫組化標記采用的是SABC法：將石蠟切片脫蠟至水，之后放進檸檬酸鹽緩沖液中，用微波熱進行修復(fù)15min左右，將其利用濃度為3%的雙氧水進行室溫孵育10min，進而利用濃度為10%的山羊血清封閉，再進行室溫孵育10min，然后將血清傾去（不洗），滴加1∶200的兔抗鼠AIF抗體，在4℃的冰箱里過夜孵育，之后進行37℃復(fù)溫1h，滴加適量的生物素將羊抗兔二抗工作液進行標記，采用37℃孵育15min。除封閉血清外，其余步驟皆采用PBS沖洗3次，每次5min左右。之后獲得相關(guān)樹膠封片，利用顯微鏡進行觀察分析。最后根據(jù)TUNEL試劑盒提供的相關(guān)試驗步驟進行操作，以對凋亡細胞進行檢測，從而獲取本研究所需相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS.12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行相關(guān)統(tǒng)計與分析，相關(guān)數(shù)據(jù)采用均數(shù)及標準差（）表示，并采用t檢驗來檢測差異性，以P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AIF表達

AIF陽性細胞呈現(xiàn)出的是棕黃色，在甲組中并為見到明顯的AIF陽性細胞；乙組與丙組在缺血再灌注1d后，皆呈現(xiàn)出了陽性細胞高峰（但差異性顯著，詳見表1），之后下降；通過統(tǒng)計學(xué)分析，可知乙組與丙組在同等時間內(nèi)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 乙組與丙組大鼠缺血再灌注后AIF陽性細胞表達對比（）

表1 乙組與丙組大鼠缺血再灌注后AIF陽性細胞表達對比（）

組別例數(shù)I/R 1dI/R 3dI/R 5d乙組7125.36±9.0783.23±8.8953.89±6.12丙組792.90±7.4975.01±7.3647.06±5.87 P值＜0.05＜0.05＜0.05

2.2 凋亡細胞檢測

TUNEL檢測凋亡細胞，其熒光顯微鏡顯示為綠色，DAB顯色之后，出現(xiàn)了棕黃色顆粒者則為凋亡細胞，而正常的細胞核則無著色，主要存在缺血周圍區(qū)，而甲組沒見到明顯的陽性細胞；乙組與丙組在缺血再灌注1d后，TUNEL凋亡細胞達到了高峰（存在明顯的差異性，詳見表2），之后下降；乙組與丙組進行對比分析可知，在同等時間內(nèi)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

神經(jīng)元的凋亡在腦缺血再灌注繼發(fā)的神經(jīng)損傷機制中有著十分重要的作用，因此利用神經(jīng)元凋亡的抑制來防治腦缺血再灌注繼發(fā)神經(jīng)元損傷已經(jīng)成為了當下研究的一大熱點?？偟膩碚f，細胞的凋亡屬于一個十分復(fù)雜的過程，涉及到了酸中毒、能量衰竭、細胞內(nèi)鈣離子的超載等。AIF屬于這些年才發(fā)現(xiàn)的一類凋亡效應(yīng)分子，屬于一種進化較為保守的黃素蛋白，一般在細胞線粒體膜間隙中，有著凋亡誘導(dǎo)的活性。AIF屬于雙功能蛋白，有著氧化還原酶的活性，同時也與線粒體的相關(guān)生理活動有著莫大的關(guān)聯(lián)[3]。而丹紅注射液屬于當前最為常見的臨床藥物，主要成為包括了、紅花黃色素與丹參等，采用的是中藥紅花與丹參科學(xué)提取精煉而成。本研究顯示，利用丹紅注射液能有效抑制AIF的表達，從而減少神經(jīng)元的凋亡，由此可見其對于大鼠腦缺血再灌注有著積極的保護作用。

表2 乙組與丙組在大鼠缺血關(guān)注后的TUNEL凋亡細胞對比（）

表2 乙組與丙組在大鼠缺血關(guān)注后的TUNEL凋亡細胞對比（）

組別例數(shù)I/R 1dI/R 3dI/R 5d乙組7102.44±9.1377.10±8.0945.79±5.62丙組781.68±8.5767.59±5.7940.59±4.35 P值＜0.05＜0.05＜0.05

[1] 王彥平,楊金升,石向群,等.大鼠局灶性腦缺血再灌注后凋亡誘導(dǎo)因子的表達與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2010, 9(6):263-264.

[2] 王彥平,楊金升,范磊.丹紅注射液對大鼠腦缺血再灌注后凋亡誘導(dǎo)因子的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2010,8(6):412-413.

[3] Chen ZQ,Hong L,Wang H.Effect of danhong injection on platelet activation and inflammatory factors in patients of acute coronary syndrome after intervention therapy[J].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi,2009,29(8):692-294.

[4] 王彥平,楊金升,范磊.艾芬地爾對腦缺血再灌注大鼠AIF表達及神經(jīng)元凋亡的影響[J].卒中與神經(jīng)疾病,2010,17(2):315-316.

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1671-8194（2013）19-0097-02