糖尿病大鼠體外循環(huán)術(shù)后認(rèn)知功能變化及海馬NF-κBp65蛋白的表達(dá)

尹光明梁衛(wèi)東鄭德玉

（1 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272029；2 山東省五蓮縣人民醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272029）

糖尿病大鼠體外循環(huán)術(shù)后認(rèn)知功能變化及海馬NF-κBp65蛋白的表達(dá)

尹光明1梁衛(wèi)東1鄭德玉2

（1 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272029；2 山東省五蓮縣人民醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272029）

目的 探討糖尿病大鼠體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）術(shù)后認(rèn)知功能的變化。方法 將 SD 大鼠隨機(jī)分成非糖尿病 CPB 組（A 組）及糖尿病 CPB 組（B 組）。腹腔一次性注射 1%STZ （溶于 pH 4.2，0.1%mol/L 檸檬酸 -檸檬酸鈉緩沖液）60mg/kg 建立糖尿病模型，糖尿病模型建立后第 7 周建立 CPB 模型。觀察糖尿病大鼠 CPB 后認(rèn)知功能的變化以及海馬 NF-κBp65 蛋白的表達(dá)，抽取靜脈血用 ELISA 法檢測 TNF-α 及 IL-10 含量。結(jié)果 各組大鼠術(shù)前認(rèn)知功能測試無顯著性差異（P＞ 0.05），體外循環(huán)后 5 天各組差異顯著，糖尿病 CPB 組（B 組）電擊次數(shù)明顯增加（P ＜ 0.05，P＜ 0.01），差別有顯著性。B 組大鼠腦組織海馬 NF-κBp65 蛋白陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。兩組大鼠血清 TNF-α 及 IL-10 含量均有增高，B 組大鼠增高更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。結(jié)論 糖尿病可以引發(fā)并加重體外循環(huán)后大鼠腦內(nèi) NF-κBp65 蛋白過度表達(dá)，促使細(xì)胞因子釋放，對腦組織產(chǎn)生損傷并出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。糖尿病通過 NF-κBp65 蛋白途徑參與糖尿病體外循環(huán)術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展。

糖尿??；NF-κBp65 蛋白；認(rèn)知功能障礙；體外循環(huán)；發(fā)病機(jī)制

自從1953年體外循環(huán)應(yīng)用于臨床以來，體外循環(huán)下心臟手術(shù)后的腦部并發(fā)癥的發(fā)生逐年增多。神經(jīng)認(rèn)知功能障礙是CPB后最為常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，成為術(shù)后主要并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致術(shù)后康復(fù)延遲、住院時(shí)間和醫(yī)療費(fèi)用增加及生活質(zhì)量的下降。糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病，隨著生活方式的改變和老齡化進(jìn)程的加速，其患病率呈快速上升趨勢。

近年來患有糖尿病患者心臟手術(shù)逐年增加，有許多臨床研究證明糖尿病患者體外循環(huán)心臟手術(shù)后的腦損傷的發(fā)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非糖尿病患者[1]?，F(xiàn)認(rèn)為糖尿病是導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的危險(xiǎn)因素之一，但引起并加重體外循環(huán)后認(rèn)知障礙發(fā)生的具體作用機(jī)制仍不清楚。目前，尚沒有采用動(dòng)物試驗(yàn)研究糖尿病體外循環(huán)后腦認(rèn)知功能障礙的報(bào)道。本研究通過觀察糖尿病大鼠體外循環(huán)后腦核轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65蛋白的表達(dá)及認(rèn)知功能的變化，以探討糖尿病在體外循環(huán)后導(dǎo)致認(rèn)知障礙的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物分組：健康成年雄性清潔級(jí)SD(Sprague-Dawley)大鼠20只，體質(zhì)量為400～450g，鼠齡16～22周，室溫溫度19～24℃，相對濕度60%～70%，常規(guī)普通飼料飼養(yǎng)，保持室內(nèi)通風(fēng)，每天維持光照8～12h。20只大鼠隨機(jī)分為正常對照組（A組）及糖尿病組（B組）。在糖尿病動(dòng)物模型建立后第七周，兩組同時(shí)建立體外循環(huán)模型。在建立糖尿病模型及CPB模型中動(dòng)物死亡視為模型復(fù)制失敗，不計(jì)在內(nèi)，用同一批次的大鼠制成合格模型后補(bǔ)充。

1.2 動(dòng)物模型制作

1.2.1 糖尿病動(dòng)物模型

20只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后建立鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma）糖尿病模型。大鼠禁食水10h，隨機(jī)抽取10只腹腔一次性注射1%STZ （溶于pH4.2，0.1%mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液）60mg/kg，其余10只大鼠注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（對照組，A組）。血糖穩(wěn)定3d后，尾靜脈隨機(jī)血糖＞16.7mmol/L認(rèn)為糖尿病模型建立成功（糖尿病組，B組）。造模成功后進(jìn)入下一步試驗(yàn)。

1.2.2 CPB動(dòng)物模型

大鼠糖尿病模型制模成功后第7周，兩組大鼠均建立CPB模型。利用大鼠專用膜式氧合器，經(jīng)右頸脈插管引流，尾動(dòng)脈插管灌注，建立CPB。CPB采用無血預(yù)充共20ml，由乳酸林格氏液12mL、6%羥乙基淀粉7mL及甘露醇1mL組成。測ACT時(shí)間＞480s時(shí)開始CPB。轉(zhuǎn)流開始灌注量約為20～40mL/（kg·min），逐漸增加達(dá)全流量160～180 mL/（kg·min），平均維持在100～120 mL/（kg·min），保持平均動(dòng)脈壓8.0～13.3kPa。根據(jù)麻醉深度適當(dāng)補(bǔ)充咪唑安定。轉(zhuǎn)流60min后停機(jī)，嚴(yán)密監(jiān)測生命體征，必要時(shí)給予鹽酸多巴胺注射液3～10μg/（kg·min） ，并根據(jù)CVP經(jīng)尾動(dòng)脈使用微量泵精確回輸機(jī)器殘留血或膠體液。采用改良的Brain同軸回路給予機(jī)械輔助呼吸，呼吸機(jī)條件根據(jù)血?dú)饨Y(jié)果調(diào)整。當(dāng)大鼠血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定后拔除測壓裝置，自主呼吸平穩(wěn)后停止機(jī)械通氣，拔除氣管導(dǎo)管。把大鼠放入觀察箱，給氧，保溫，自由進(jìn)水及食物，觀察5d。

表1 兩組各時(shí)間點(diǎn)血糖值比較（χ—±s，mmol/L）

1.3 行為學(xué)檢測

應(yīng)用MG-2型電迷宮進(jìn)行行為學(xué)測試[5]，以試驗(yàn)對象被電擊后從電擊區(qū)一次性逃至安全區(qū)為“正確”，連續(xù)訓(xùn)練，記錄試驗(yàn)對象達(dá)到學(xué)會(huì)（連續(xù)10次測試中9次正確確定為“學(xué)會(huì)”）標(biāo)準(zhǔn)所需的電擊次數(shù)，作為判斷測試對象學(xué)習(xí)記憶的指標(biāo)。行為學(xué)測試分別于糖尿病模型建立前、CPB模型建立前一周即糖尿病模型建立后第6周及CPB后5d進(jìn)行，于當(dāng)天上午進(jìn)行。

1.4 血糖檢測

在糖尿病模型建立前（T1）、糖尿病模型建立后第5周（T2）、CPB模型建立前（T3）、CPB結(jié)束（T4）、CPB后3d（T5）及CPB術(shù)后5d（T6）不同時(shí)間點(diǎn)從大鼠尾靜脈采血測血糖。

1.5 NF-κBp65蛋白表達(dá)

采用免疫組化法檢測NF-κBp65蛋白表達(dá)，陽性細(xì)胞為胞體內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，以胞漿出現(xiàn)為主，強(qiáng)陽性時(shí)細(xì)胞核也出現(xiàn)棕黃色顆粒。在200倍光鏡下觀察海馬CA3區(qū)，選取十個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性神經(jīng)元數(shù)，以均值代表該切片的陽性神經(jīng)元數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Spss11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，組間比較用方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)血糖值比較

對照組（A組）血糖較糖尿病組（B組）低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著時(shí)間延長，各組血糖值輕度升高，同組比較P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.2 行為學(xué)檢測

兩組大鼠在糖尿病模型及CPB模型建立前測試無顯著性差異（P＞0.05）；CPB后5d測試兩組差異顯著，糖尿病模型組模型組電擊次數(shù)明顯增加（P＜0.01）。見表2。

表2 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)檢測結(jié)果（電擊次數(shù)，χ—±s）

2.3 腦組織NF-κBp65蛋白表達(dá)

對照組大鼠在CPB模型建立前未見腦組織NF-κBp65蛋白表達(dá)，糖尿病組在CPB模型建立前已有NF-κBp65蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞，主要染色在細(xì)胞漿，無明顯核染色。至CPB結(jié)束后5d，對照組才出現(xiàn)NF-κBp65蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞，而糖尿病組大鼠腦組織海馬NF-κBp65蛋白陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，且已有明顯細(xì)胞核著色，結(jié)果具有顯著性意義（P＜0.05）。NF-κBp65蛋白陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)見表3。

表3 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬NF-κBp65蛋白陽性細(xì)胞數(shù)比較（χ—±s）

2.4 相關(guān)性分析

NF-κB表達(dá)與認(rèn)知功能障礙有明顯正相關(guān)關(guān)系（r=0.69，P＜0.05），海馬NF-κB表達(dá)越多，發(fā)生認(rèn)知功能障礙的概率增加。

3 討 論

CPB自從上世紀(jì)50年代引入臨床，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于外科手術(shù)中。盡管CPB材料不斷更新，技術(shù)不斷進(jìn)步，但是其本身仍然是心臟手術(shù)術(shù)后并發(fā)癥的主要原因[2]。神經(jīng)認(rèn)知功能障礙是CPB術(shù)后最為常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。CPB后并發(fā)癥一般與微栓子、低灌注和炎癥反應(yīng)有關(guān)，而相應(yīng)的危險(xiǎn)因素則包括：高齡、高血壓、心腦血管疾病及糖尿病等。隨著糖尿病的發(fā)病率逐年增多，糖尿病成為越來越突出的危險(xiǎn)因素。

糖尿病是認(rèn)知功能障礙的危險(xiǎn)因素[3]，并且使患者體外循環(huán)術(shù)后認(rèn)知功能障礙加重，預(yù)后差，但糖尿病引起并加重患者體外循環(huán)后認(rèn)知功能障礙的機(jī)制仍不完全清楚。

糖尿病患者全身和局部炎性反應(yīng)增強(qiáng)，其產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)與NF-κB的異常表達(dá)有關(guān)。有研究顯示，無論糖尿病病程長短，患者體內(nèi)多種組織均有NF-κB的異常表達(dá)[4-10]。體外循環(huán)時(shí)血液直接與人工心肺機(jī)的異物表面接觸、手術(shù)創(chuàng)傷、組織器官的缺血再灌注損傷等均可誘發(fā)補(bǔ)體、凝血因子等瀑布樣激活，粘附分子表達(dá)，并使單核巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)，炎性反應(yīng)在術(shù)后的組織損傷及器官功能失調(diào)中起重要作用。CPB心臟直視手術(shù)所致腦損傷主要與CPB期間大腦組織缺血缺氧有關(guān)。CPB后腦損傷可表現(xiàn)為術(shù)后認(rèn)知障礙，神經(jīng)功能評分下降[11,12]。很多研究提示體外循環(huán)后機(jī)體內(nèi)均有NF-κB激活[13]。

在炎癥反應(yīng)的復(fù)雜細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，NF-κB可調(diào)節(jié)多種促炎因子的表達(dá)，是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最重要的調(diào)控因子之一，被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。NF-κB能啟動(dòng)與免疫和炎癥有關(guān)的基因，這些基因的轉(zhuǎn)錄，在炎癥和自身免疫反應(yīng)中起重要作用[14]。炎癥因子作為新的NF-κB激活劑，進(jìn)一步使NF-κB持續(xù)活化又誘導(dǎo)相應(yīng)基因持續(xù)轉(zhuǎn)錄，引起炎癥反應(yīng)的放大及惡性循環(huán)[15,16]，加重組織器官的再灌注損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型建立第6周，海馬有NF-κB蛋白的表達(dá)，而對照組在相同時(shí)間點(diǎn)NF-κB蛋白表達(dá)，提示高血糖可激活NF-κB，使NF-κB的活性增強(qiáng)。體外循環(huán)后兩組大鼠NF-κB蛋白表達(dá)明顯增多，但糖尿病組大鼠NF-κB蛋白表達(dá)更明顯，提示CPB進(jìn)一步激活腦組織NF-κB蛋白表達(dá)，從而加重放大了一系列炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重腦組織損傷。

在本研究中，認(rèn)知功能障的發(fā)生與NF-κB表達(dá)呈正相關(guān)，證實(shí)了NF-κB在認(rèn)知功能障礙中起作用，從而提示了核因子NF-κB表達(dá)增強(qiáng)，可加重糖尿病體外循環(huán)后腦功能損傷，產(chǎn)生認(rèn)知功能障礙。

本研究顯示糖尿病可使腦組織NF-κB的激活，NF-κB可調(diào)節(jié)多種促炎因子的表達(dá)，是炎癥反應(yīng)的中心靶點(diǎn)，是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最重要的調(diào)控因子，因此認(rèn)為糖尿病加重體外循環(huán)后認(rèn)知功能障礙可能與激活NF-κB有關(guān)。NF-κB激活是糖尿病加重體外循環(huán)術(shù)后認(rèn)知功能障礙的重要機(jī)制之一。

綜上所述，高血糖可以引發(fā)腦內(nèi)NF-κB活化，CPB進(jìn)一步加重腦內(nèi)NF-κB活化，并產(chǎn)生認(rèn)知功能障礙。NF-κB活化作為重要的始動(dòng)及促進(jìn)因子參與了糖尿病體外循環(huán)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展。因此，對NF-κB活化與認(rèn)知功能障礙關(guān)系的深入研究，有可能找到一條新的有效的干預(yù)糖尿病體外循環(huán)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展途徑。

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Influence of α-lipoicacid to Cognition Function Impairment and NF-κBp65 Expression of Hippocampus after Cardiopulmonary Bypass in Diabetic rats

YIN Guang-ming1, LIANG Wei-dong1, ZHENG De-yu2
(1 The Affiliated Hospital of Jining Medical University ,Jining 272029, China;2 Wulian People's Hospital, Jining 272029, China)

ObjectiveDiabetic rats cardiopulmonary bypass (cardiopulmonary bypass, CPB) changes in postoperative cognitive function..MethodsSD rats were randomly divided into non-diabetic CPB group (A) and diabetes CPB group (B). Intraperitoneal single injection of 1% STZ (dissolved in pH 4.2, 0.1% mol/L citric acid - sodium citrate buffer) 60mg/kg create a model of diabetes, diabetic model after 7 weeks in CPB model. Of diabetic rats after CPB cognitive function changes, and the hippocampus the NF-κBp65 protein expression to extract the venous blood ELISA was used to detect TNF-α and IL-10 levels.ResultsTests of cognitive function in rats preoperative significant difference (P＞0.05), five days after cardiopulmonary bypass groups significantly different, diabetes CPB group (B) the number of shocks increased significantly (P＜0.05, P＜0.01), the difference is significant. Group B rat brain hippocampus the NF-κBp65 protein-positive cells increased significantly, and the difference was statistically significant (P＜ 0.01). The two groups of serum TNF-α and IL-10 levels have increased more significantly increased B rats, the difference was statistically significant (P＜0.05).ConclusionsDiabetes can trigger and aggravate cardiopulmonary bypass the rat brain of NF-κBp65 protein overexpression, prompting the release of cytokines, brain tissue damage and cognitive dysfunction. Diabetes through NF-κBp65 protein pathways involved in the development of diabetes the extracorporeal circulation postoperative cognitive dysfunction.

Diabetes; NF-κBp65 protein; Cognitive dysfunction; Cardiopulmonary bypass; Pathogenesis

R587.1

：B

：1671-8194（2013）04-0055-03