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    靜電紡絲素蛋白-PLGA神經(jīng)移植物的生物相容性評(píng)價(jià)*

    2013-06-19 02:22:08趙亞紅季亞瑋王亞玲楊宇民
    交通醫(yī)學(xué) 2013年1期
    關(guān)鍵詞:施萬大白兔絲素

    劉 瓊,趙 婧,趙亞紅,季亞瑋,王亞玲,楊宇民

    (南通大學(xué)江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇226001)

    蠶絲主要由外面包裹的絲膠蛋白和內(nèi)芯的絲素蛋白組成。來自Bombyx mori蠶屬的蠶絲尤其具有良好的性能[1-2],在生物材料方面的應(yīng)用歷史悠久,臨床上很早就用于縫合材料[3-4]。絲膠蛋白帶有免疫原性,容易引起異體排斥反應(yīng)[5-7]。顧曉松等將除去絲膠的絲素蛋白制備成神經(jīng)移植物,并首次用于外周神經(jīng)的修復(fù)取得了良好的效果[8],且有利于施萬細(xì)胞的生長,不產(chǎn)生任何毒副作用[9]。PLGA是由乳酸(LA)和羥基乙醇酸(GA)共聚合而成,具有良好的生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性[10-11]等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于藥物釋放,組織工程和骨科手術(shù)中。本實(shí)驗(yàn)室通過靜電紡和編織纏繞的方法,制備出一種新型的靜電紡SP-NGCS。但PLGA手術(shù)縫線和靜電紡絲素蛋白共混之后在體內(nèi)外的生物相容性如何,是否會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良反應(yīng)?本實(shí)驗(yàn)初步對(duì)共混的靜電紡SP-NGCS體外細(xì)胞培養(yǎng)和大白兔皮下植入,對(duì)其進(jìn)行毒性測(cè)試和局部組織反應(yīng)觀察。

    1 材料與方法

    1.1 材料 (1)絲素溶液:將蠶絲在0.5%的Na2CO3溶液中脫膠,脫膠的絲素蛋白纖維溶解在三元溶劑體系[CaCl2/H2O/EtOH(摩爾比1:8:2]中,透析后鑄膜。揭下后的絲素膜用99%的甲酸溶液溶解,形成13%~17%的絲素溶液。(2)靜電紡SP-NGCS:將15%的絲素溶液靜電紡絲,直徑2mm的圓柱軸接收,紡絲一段時(shí)間后,取下,編織一層PLGA手術(shù)縫線后繼續(xù)靜電紡絲,無水乙醇處理20min,制備成共混的靜電紡SP-NGCS。

    1.2 方法 (1)浸提液的制備:按照國家生物安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),將樣品高溫高壓滅菌后,DMEM培養(yǎng)基浸提,置于37℃的培養(yǎng)箱浸提72±2h。實(shí)驗(yàn)組按照制備6cm2/mL浸提液的SP-NGCS,陽性對(duì)照組為0.01g/mL 的 β-TCP 浸提液,陰性對(duì)照組為 0.01g/mL的有機(jī)錫浸提液,分別配制成含有胎牛血清10%,青霉素1×104U/mL和鏈霉素1×104μg/mL的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)施萬細(xì)胞。(2)施萬細(xì)胞的原代取材和純化:取1~3d SD紅皮大鼠的背根節(jié)和坐骨神經(jīng),胰酶消化30min后過篩網(wǎng)種植到培養(yǎng)皿中,阿糖胞苷作用48h后使其增殖,再用Thy1.1抗體和補(bǔ)體作用純化,純化后得到純度為85%以上的施萬細(xì)胞。(3)施萬細(xì)胞與浸提液共培養(yǎng):純化后的施萬細(xì)胞按照104個(gè)孔種入到96孔板中,分為4組:實(shí)驗(yàn)組(SP-NGCS浸提液),陰性對(duì)照組(β-TCP浸提液),陽性對(duì)照組(有機(jī)錫浸提液)和空白對(duì)照組。分別用含有SPNGCS,β-TCP和有機(jī)錫浸提液的完全培養(yǎng)基和DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)施萬細(xì)胞,觀察12h,24h,48h,72h和7d時(shí)施萬細(xì)胞的生長形態(tài)。同時(shí)采用MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽]法檢測(cè)細(xì)胞活力:在不同的時(shí)間點(diǎn),0.01MPBS輕輕洗滌3遍后,每孔加入100μLMTT(濃度:5mg/mL,溶于 0.01mol/L PBS 中,pH7.2),37℃孵育 4h;吸出反應(yīng)液后加入10%SDS,37℃孵育24h后利用ELX-800酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定吸光度值。并計(jì)算相對(duì)增殖率 (RGR):RGR=(實(shí)驗(yàn)組均值/陰性對(duì)照組均值)×100%,RGR越大,則材料毒性越小。對(duì)支架材料的細(xì)胞毒性程度進(jìn)行分級(jí),以陰性對(duì)照組的值作為100%的細(xì)胞增殖率。RGR≥100%為0級(jí),75%≤RGR≤99%為 1級(jí),50%≤RGR≤74%為 2級(jí),25%≤RGR≤49%為3級(jí),1%≤RGR≤24%為4級(jí),RGR=0為5級(jí)。毒性分級(jí):0~1級(jí)為合格,2級(jí)需結(jié)合細(xì)胞形態(tài)分析綜合評(píng)價(jià),3~5級(jí)為不合格。(4)大白兔皮下植入實(shí)驗(yàn):將本實(shí)驗(yàn)自制的SP-NGCS剪成10mm長度,消毒滅菌備用。成年新西蘭大白兔5只,皮下植入SP-NGCS,植入后2W,4W,8W,12W,24W取材并拍照,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材6個(gè)。3%的戊巴比妥鈉麻醉大白兔,于背部中心部位備皮(8cm×14cm),鋪上消毒洞巾。在兩側(cè)距脊柱周2cm處各做3個(gè)5mm長的切口,每個(gè)切口間相距4cm,各植入一個(gè)10mm長度的SP NGCS,皮膚縫合后75%乙醇消毒,術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材后4%的多聚甲醛固定,10%,20%,30%蔗糖脫水,冰凍切片,HE染色,顯微鏡下觀察并拍照。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用OriginLab OriginPro統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±s表示,采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 體外細(xì)胞培養(yǎng) 12h后通過顯微鏡拍照觀察,實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞呈長梭型,且透光性好,形態(tài)均一,胞體飽滿。而陽性對(duì)照組施萬細(xì)胞胞體開始收縮成球團(tuán)。24h后實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞都開始慢慢增殖,細(xì)胞數(shù)目增多。而陽性對(duì)照組施萬細(xì)胞大片成團(tuán),出現(xiàn)懸浮的死細(xì)胞,肉眼觀察細(xì)胞絕大部分都已死亡(圖1)。MTT細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果表明,陽性對(duì)照組RGR值在10.9%~19.0%,具有明顯的細(xì)胞毒性,即有機(jī)錫浸提液細(xì)胞毒性為4級(jí)。然而SP-NGCS浸提液組RGR值在98.6%~103.7%,細(xì)胞毒性為 0 級(jí)或 1 級(jí),結(jié)果表明SP-NGCS無細(xì)胞毒性,表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性,符合生物材料細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的安全標(biāo)準(zhǔn)(表1)。

    圖1 施萬細(xì)胞培養(yǎng)24h后的生長形態(tài)

    表1 各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(A值,xˉ±s)

    2.2 大白兔皮下植入及取材 (1)一般情況:術(shù)后所有動(dòng)物均無明顯異常,手術(shù)傷口均愈合,且傷口無明顯紅腫、硬結(jié)、感染、出血等不良反應(yīng)出現(xiàn)。(2)2W,4W,8W,12W,24W肉眼觀察,SP-NGCS導(dǎo)管周圍未見組織壞死和化膿等現(xiàn)象出現(xiàn),且隨著時(shí)間延長、導(dǎo)管形狀逐漸變小、最終塌陷,到24W時(shí)已大部分降解(圖 2)。

    圖2 大白兔皮下植入后不同時(shí)間取材

    2.3 組織形態(tài)學(xué)觀察 將各時(shí)間點(diǎn)取材的組織切片經(jīng)HE染色后顯微鏡下觀察,2W導(dǎo)管外圍包裹薄層結(jié)締組織,以增生性纖維細(xì)胞為主。管腔中見中性粒細(xì)胞浸潤,出現(xiàn)吞噬材料的巨噬細(xì)胞。管腔兩端有少量纖維結(jié)締組織長入。4W導(dǎo)管外圍包裹的結(jié)締組織略有增厚,以增生性纖維細(xì)胞為主。管腔中見中性粒細(xì)胞浸潤,可見巨噬細(xì)胞。管腔兩端有少量纖維結(jié)締組織長入。8W導(dǎo)管外圍包裹的結(jié)締組織開始變薄,仍以增生性纖維細(xì)胞為主。管腔中見中性粒細(xì)胞浸潤但數(shù)量減少,巨噬細(xì)胞數(shù)量增多;見少量淋巴細(xì)胞,管腔兩端有較多纖維結(jié)締組織長入。12W導(dǎo)管外圍包裹的結(jié)締組織進(jìn)一步變薄,仍以增生性纖維細(xì)胞為主。管腔中仍可見中性粒細(xì)胞浸潤但數(shù)量進(jìn)一步減少,仍見較多巨噬細(xì)胞,淋巴細(xì)胞數(shù)量增多。管腔兩端仍有較多纖維結(jié)締組織長入,管壁變得疏松多處斷裂,管腔不完整。24W導(dǎo)管大部分被降解吸收未獲得組織切片,各時(shí)間點(diǎn)導(dǎo)管周圍均未見肉芽腫及組織壞死等不良反應(yīng)(圖3)。

    圖3 不同時(shí)間取材的組織切片HE染色

    3 討 論

    作為人工神經(jīng)移植物必須具備良好的生物相容性,即對(duì)細(xì)胞沒有任何毒性,細(xì)胞可正常生長。移植入體內(nèi)后不會(huì)引起任何免疫排斥反應(yīng)。支架對(duì)周圍的組織無毒副作用、無致崎性和致突變。反過來周圍組織不會(huì)對(duì)支架產(chǎn)生腐蝕效應(yīng)和免疫反應(yīng),不妨礙神經(jīng)組織在導(dǎo)管內(nèi)的生長。最后材料本身可被逐漸降解和吸收,并最終從植入部位消失。

    當(dāng)生物材料移植入機(jī)體后,局部組織會(huì)對(duì)外來異物產(chǎn)生本能的防御性反應(yīng)。如果植入材料有毒物滲出,炎性反應(yīng)加劇,嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成組織壞死。如果植入物長期不能降解,就會(huì)被淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和膠原纖維包裹,形成纖維性包膜囊。如果材料穩(wěn)定沒有毒物滲出,在6個(gè)月或更長時(shí)間內(nèi)纖維包囊會(huì)變薄,囊壁中淋巴組織消失。

    根據(jù)國家生物安全性標(biāo)準(zhǔn),分別選用β-TCP為陰性對(duì)照組的浸提材料,Sn為陽性對(duì)照組的浸提材料,目前已證實(shí)β-TCP具有良好的生物相容性,有機(jī)錫對(duì)細(xì)胞有毒害作用。將SP-NGCS制備的浸提液與原代取材的施萬細(xì)胞共培養(yǎng),細(xì)胞生長狀態(tài)良好,同時(shí)MTT檢測(cè)結(jié)果可看出SP-NGCS浸提液對(duì)施萬細(xì)胞沒有毒性作用。同時(shí),SP-NGCS植入大白兔背部皮下局部反應(yīng)輕,具有良好的生物相容性和生物可降解性。因此共混的靜電紡SP-NGCS具有良好的生物相容性,有望于作為理想的人工神經(jīng)移植物,應(yīng)用于修復(fù)周圍神經(jīng)缺損。

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