靜電紡絲素蛋白-PLGA神經(jīng)移植物的生物相容性評(píng)價(jià)*

劉 瓊，趙 婧，趙亞紅，季亞瑋，王亞玲，楊宇民

（南通大學(xué)江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇226001）

蠶絲主要由外面包裹的絲膠蛋白和內(nèi)芯的絲素蛋白組成。來自Bombyx mori蠶屬的蠶絲尤其具有良好的性能[1-2]，在生物材料方面的應(yīng)用歷史悠久，臨床上很早就用于縫合材料[3-4]。絲膠蛋白帶有免疫原性，容易引起異體排斥反應(yīng)[5-7]。顧曉松等將除去絲膠的絲素蛋白制備成神經(jīng)移植物，并首次用于外周神經(jīng)的修復(fù)取得了良好的效果[8]，且有利于施萬細(xì)胞的生長，不產(chǎn)生任何毒副作用[9]。PLGA是由乳酸（LA）和羥基乙醇酸（GA）共聚合而成，具有良好的生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性[10-11]等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于藥物釋放，組織工程和骨科手術(shù)中。本實(shí)驗(yàn)室通過靜電紡和編織纏繞的方法，制備出一種新型的靜電紡SP-NGCS。但PLGA手術(shù)縫線和靜電紡絲素蛋白共混之后在體內(nèi)外的生物相容性如何，是否會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良反應(yīng)？本實(shí)驗(yàn)初步對(duì)共混的靜電紡SP-NGCS體外細(xì)胞培養(yǎng)和大白兔皮下植入，對(duì)其進(jìn)行毒性測(cè)試和局部組織反應(yīng)觀察。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）絲素溶液：將蠶絲在0.5%的Na2CO3溶液中脫膠，脫膠的絲素蛋白纖維溶解在三元溶劑體系[CaCl2/H2O/EtOH(摩爾比1:8:2]中，透析后鑄膜。揭下后的絲素膜用99%的甲酸溶液溶解，形成13%～17%的絲素溶液。（2）靜電紡SP-NGCS：將15%的絲素溶液靜電紡絲，直徑2mm的圓柱軸接收，紡絲一段時(shí)間后，取下，編織一層PLGA手術(shù)縫線后繼續(xù)靜電紡絲，無水乙醇處理20min，制備成共混的靜電紡SP-NGCS。

1.2 方法 （1）浸提液的制備：按照國家生物安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，將樣品高溫高壓滅菌后，DMEM培養(yǎng)基浸提，置于37℃的培養(yǎng)箱浸提72±2h。實(shí)驗(yàn)組按照制備6cm2/mL浸提液的SP-NGCS，陽性對(duì)照組為0.01g/mL 的 β-TCP 浸提液，陰性對(duì)照組為 0.01g/mL的有機(jī)錫浸提液，分別配制成含有胎牛血清10%，青霉素1×104U/mL和鏈霉素1×104μg/mL的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)施萬細(xì)胞。（2）施萬細(xì)胞的原代取材和純化：取1～3d SD紅皮大鼠的背根節(jié)和坐骨神經(jīng)，胰酶消化30min后過篩網(wǎng)種植到培養(yǎng)皿中，阿糖胞苷作用48h后使其增殖，再用Thy1.1抗體和補(bǔ)體作用純化，純化后得到純度為85%以上的施萬細(xì)胞。（3）施萬細(xì)胞與浸提液共培養(yǎng)：純化后的施萬細(xì)胞按照104個(gè)孔種入到96孔板中，分為4組：實(shí)驗(yàn)組（SP-NGCS浸提液），陰性對(duì)照組（β-TCP浸提液），陽性對(duì)照組（有機(jī)錫浸提液）和空白對(duì)照組。分別用含有SPNGCS，β-TCP和有機(jī)錫浸提液的完全培養(yǎng)基和DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)施萬細(xì)胞，觀察12h，24h，48h，72h和7d時(shí)施萬細(xì)胞的生長形態(tài)。同時(shí)采用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]法檢測(cè)細(xì)胞活力：在不同的時(shí)間點(diǎn)，0.01MPBS輕輕洗滌3遍后，每孔加入100μLMTT（濃度：5mg/mL，溶于 0.01mol/L PBS 中，pH7.2），37℃孵育 4h；吸出反應(yīng)液后加入10%SDS，37℃孵育24h后利用ELX-800酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定吸光度值。并計(jì)算相對(duì)增殖率 (RGR)：RGR=(實(shí)驗(yàn)組均值/陰性對(duì)照組均值)×100%，RGR越大，則材料毒性越小。對(duì)支架材料的細(xì)胞毒性程度進(jìn)行分級(jí)，以陰性對(duì)照組的值作為100%的細(xì)胞增殖率。RGR≥100%為0級(jí)，75%≤RGR≤99%為 1級(jí)，50%≤RGR≤74%為 2級(jí)，25%≤RGR≤49%為3級(jí)，1%≤RGR≤24%為4級(jí)，RGR=0為5級(jí)。毒性分級(jí)：0～1級(jí)為合格，2級(jí)需結(jié)合細(xì)胞形態(tài)分析綜合評(píng)價(jià)，3～5級(jí)為不合格。（4）大白兔皮下植入實(shí)驗(yàn)：將本實(shí)驗(yàn)自制的SP-NGCS剪成10mm長度，消毒滅菌備用。成年新西蘭大白兔5只，皮下植入SP-NGCS，植入后2W,4W,8W,12W,24W取材并拍照，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材6個(gè)。3%的戊巴比妥鈉麻醉大白兔，于背部中心部位備皮（8cm×14cm）,鋪上消毒洞巾。在兩側(cè)距脊柱周2cm處各做3個(gè)5mm長的切口，每個(gè)切口間相距4cm，各植入一個(gè)10mm長度的SP NGCS，皮膚縫合后75%乙醇消毒，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材后4%的多聚甲醛固定，10%，20%，30%蔗糖脫水，冰凍切片，HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用OriginLab OriginPro統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 體外細(xì)胞培養(yǎng) 12h后通過顯微鏡拍照觀察，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞呈長梭型，且透光性好，形態(tài)均一，胞體飽滿。而陽性對(duì)照組施萬細(xì)胞胞體開始收縮成球團(tuán)。24h后實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞都開始慢慢增殖，細(xì)胞數(shù)目增多。而陽性對(duì)照組施萬細(xì)胞大片成團(tuán)，出現(xiàn)懸浮的死細(xì)胞，肉眼觀察細(xì)胞絕大部分都已死亡（圖1）。MTT細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果表明，陽性對(duì)照組RGR值在10.9%～19.0%，具有明顯的細(xì)胞毒性，即有機(jī)錫浸提液細(xì)胞毒性為4級(jí)。然而SP-NGCS浸提液組RGR值在98.6%～103.7%，細(xì)胞毒性為 0 級(jí)或 1 級(jí)，結(jié)果表明SP-NGCS無細(xì)胞毒性，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性，符合生物材料細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的安全標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

圖1 施萬細(xì)胞培養(yǎng)24h后的生長形態(tài)

表1 各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（A值，xˉ±s）

2.2 大白兔皮下植入及取材 （1）一般情況：術(shù)后所有動(dòng)物均無明顯異常，手術(shù)傷口均愈合，且傷口無明顯紅腫、硬結(jié)、感染、出血等不良反應(yīng)出現(xiàn)。（2）2W，4W，8W，12W，24W肉眼觀察，SP-NGCS導(dǎo)管周圍未見組織壞死和化膿等現(xiàn)象出現(xiàn)，且隨著時(shí)間延長、導(dǎo)管形狀逐漸變小、最終塌陷，到24W時(shí)已大部分降解（圖 2）。

圖2 大白兔皮下植入后不同時(shí)間取材

2.3 組織形態(tài)學(xué)觀察 將各時(shí)間點(diǎn)取材的組織切片經(jīng)HE染色后顯微鏡下觀察，2W導(dǎo)管外圍包裹薄層結(jié)締組織，以增生性纖維細(xì)胞為主。管腔中見中性粒細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)吞噬材料的巨噬細(xì)胞。管腔兩端有少量纖維結(jié)締組織長入。4W導(dǎo)管外圍包裹的結(jié)締組織略有增厚，以增生性纖維細(xì)胞為主。管腔中見中性粒細(xì)胞浸潤，可見巨噬細(xì)胞。管腔兩端有少量纖維結(jié)締組織長入。8W導(dǎo)管外圍包裹的結(jié)締組織開始變薄，仍以增生性纖維細(xì)胞為主。管腔中見中性粒細(xì)胞浸潤但數(shù)量減少，巨噬細(xì)胞數(shù)量增多；見少量淋巴細(xì)胞，管腔兩端有較多纖維結(jié)締組織長入。12W導(dǎo)管外圍包裹的結(jié)締組織進(jìn)一步變薄，仍以增生性纖維細(xì)胞為主。管腔中仍可見中性粒細(xì)胞浸潤但數(shù)量進(jìn)一步減少，仍見較多巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞數(shù)量增多。管腔兩端仍有較多纖維結(jié)締組織長入，管壁變得疏松多處斷裂，管腔不完整。24W導(dǎo)管大部分被降解吸收未獲得組織切片，各時(shí)間點(diǎn)導(dǎo)管周圍均未見肉芽腫及組織壞死等不良反應(yīng)（圖3）。

圖3 不同時(shí)間取材的組織切片HE染色

3 討 論

作為人工神經(jīng)移植物必須具備良好的生物相容性，即對(duì)細(xì)胞沒有任何毒性，細(xì)胞可正常生長。移植入體內(nèi)后不會(huì)引起任何免疫排斥反應(yīng)。支架對(duì)周圍的組織無毒副作用、無致崎性和致突變。反過來周圍組織不會(huì)對(duì)支架產(chǎn)生腐蝕效應(yīng)和免疫反應(yīng)，不妨礙神經(jīng)組織在導(dǎo)管內(nèi)的生長。最后材料本身可被逐漸降解和吸收，并最終從植入部位消失。

當(dāng)生物材料移植入機(jī)體后，局部組織會(huì)對(duì)外來異物產(chǎn)生本能的防御性反應(yīng)。如果植入材料有毒物滲出，炎性反應(yīng)加劇，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成組織壞死。如果植入物長期不能降解，就會(huì)被淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和膠原纖維包裹，形成纖維性包膜囊。如果材料穩(wěn)定沒有毒物滲出，在6個(gè)月或更長時(shí)間內(nèi)纖維包囊會(huì)變薄，囊壁中淋巴組織消失。

根據(jù)國家生物安全性標(biāo)準(zhǔn)，分別選用β-TCP為陰性對(duì)照組的浸提材料，Sn為陽性對(duì)照組的浸提材料，目前已證實(shí)β-TCP具有良好的生物相容性，有機(jī)錫對(duì)細(xì)胞有毒害作用。將SP-NGCS制備的浸提液與原代取材的施萬細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，同時(shí)MTT檢測(cè)結(jié)果可看出SP-NGCS浸提液對(duì)施萬細(xì)胞沒有毒性作用。同時(shí)，SP-NGCS植入大白兔背部皮下局部反應(yīng)輕，具有良好的生物相容性和生物可降解性。因此共混的靜電紡SP-NGCS具有良好的生物相容性，有望于作為理想的人工神經(jīng)移植物，應(yīng)用于修復(fù)周圍神經(jīng)缺損。

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