老年性癡呆動物模型研究進(jìn)展

摘 要 老年性癡呆（Alzheimer disease，AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。由于發(fā)病機制復(fù)雜，至今其病因不明，制約了該病動物模型的制作研究工作。但隨著社會老齡化問題日益嚴(yán)重，老年癡呆相關(guān)機制和治療成了熱點和難點，關(guān)于老年癡呆動物模型的研究也越來越多樣和深入。本文總結(jié)了近幾年來國內(nèi)外對老年癡呆動物模型的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因與復(fù)合型動物模型已逐漸成為研究趨勢。

關(guān)鍵詞 老年性癡呆 動物模型 研究進(jìn)展

中圖分類號：R741 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

癡呆是由于腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性和持續(xù)性智能障礙綜合征，癡呆的發(fā)病率和患病率隨年齡增加而上升。通常引起癡呆的原因包括變性病性和非變性病性，老年性癡呆屬于變性病性疾病，也稱為阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD），是一種以進(jìn)行性記憶力障礙、判斷推理能力障礙、運動障礙為主要臨床特征的老年性疾病， AD 患者整個大腦彌散性萎縮，形成以 -淀粉樣蛋白（amyloid beda protein，簡稱A ），繼而大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)出現(xiàn)以A 為核心老年斑（senileplaque， SP）及以異常過度磷酸化的以 tau 蛋白為核心成分的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibriltary tangle，NFT）等神經(jīng)病理性病變，還會出現(xiàn)“AMY”斑塊，這是與A 形似的斑塊，但無淀粉樣核心。

隨著人口老齡化問題日益嚴(yán)重，AD已經(jīng)成為人類第4大死亡原因，運用動物模型進(jìn)行防治老年性癡呆研究已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點之一。 中國由于獨生子女政策，獨居老人也與日俱增，已然進(jìn)入老齡化社會，老年性癡呆人數(shù)也日益增長。而 AD涉及多種復(fù)雜的病理改變，病因不明，因此建立一種理想化的 AD 動物模型進(jìn)行老年癡呆相關(guān)機制和治療方法成了熱點和難點。作者查閱近幾年來國內(nèi)外對老年癡呆動物模型的各種研究文獻(xiàn)，總結(jié)了AD 動物模型的研究進(jìn)展情況。

1 快速老化小鼠（Senescence-Accelerated Mouse SAM）模型

20世紀(jì)80年代，學(xué)者Takeda T， Hosokawa M等在普通的遺傳群AKR系小鼠中通過表型選擇培育出一種快速老化小鼠—SAM，6個月大的時候出現(xiàn)了系統(tǒng)性淀粉樣變。 A 是淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）的代謝產(chǎn)物，它是老年斑的主要成分，目前認(rèn)為A 神經(jīng)毒性作用是各種原因引起AD的共同通路，其在腦組織中含量的異常增加可能是誘發(fā)AD的主要因素。而SAMP增齡過程中學(xué)習(xí)記憶障礙發(fā)生機制與腦中出現(xiàn)大量A 沉積有關(guān)。 近年，Atsuyoshi Shimada等學(xué)者以SAMP10為模型研究免疫與年齡相關(guān)的因素干擾影響大腦組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)如何導(dǎo)致老年性神經(jīng)退行性病變。 SAM模型的缺點是價格較昂貴，壽命短，雖然可以應(yīng)用于抗衰老及AD 治療方面的實驗研究，但不宜用作長期實驗。

2 以 D-半乳糖（D-galactose，D-gal）損害為主的動物模型

國外最早將D-gal動物模型用于白內(nèi)障的研究，我國學(xué)者發(fā)展并完善了該模型。 2003年，Shih-Ching Ho等學(xué)者建立了一個D-gal誘發(fā)氧化損害模擬老化小鼠的模型。 同年，羅煥敏等學(xué)者利用D-gal和亞硝酸鈉合并制備了一種新的老年癡呆模型，造模方法是小鼠每日腹腔注射D-gal120 mg/kg和亞硝酸鈉90 mg/kg，連續(xù)60 d；空白對照組腹腔注射等體積生理鹽水。 這些模型都在一定程度上模擬了 AD 的發(fā)病特點，出現(xiàn)了衰老、學(xué)習(xí)認(rèn)知能力減退、超氧化物歧化酶（SOD） 、過氧化氫酶（CAT）活力下降、大腦皮層和海馬神經(jīng)元變性壞死等特點。2011年，Xiao F等學(xué)者利用D-gal與aluminium（AL）聯(lián)合皮下注射昆明小鼠連續(xù)10周，分別使用Morri水迷宮測試，染色及生化指標(biāo)等測試模型小鼠的學(xué)習(xí)和記憶、膽堿能系統(tǒng)變化，以及蛋白質(zhì) 淀粉樣蛋白（A ）的含量，顯示有明顯的學(xué)習(xí)和記憶缺陷，并顯示大腦乙酰膽堿（ACh）的水平減少，老年斑（SP） 形成和神經(jīng)元纖維糾結(jié)結(jié)構(gòu)也被觀察到， 證明聯(lián)合使用D-gal和AL也可建立一個有效的研究AD的發(fā)病機制的模型。

同時D-gal也能使動物提前衰老。研究表明，在水迷宮實驗中，D-半乳糖模型鼠較正常鼠的逃避時間顯著延長，游泳距離增加。 生化改變方面，D-gal模型組鼠較之正常鼠血液中丙二醛（MDA）含量升高，SOD、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性下降； 肝臟組織MDA含量增高，谷氨酰胺合成酶和乳酸脫氫酶（LDH）活性降低。 組織神經(jīng)改變方面，D-gal可加速caspase介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡和抑制神經(jīng)元的形成。采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的UTP 缺口末端標(biāo)記法即TUNEL法檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)齒狀回、海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞顯著增加，海馬CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞層觀察到大量細(xì)胞萎縮和核固縮。 分子生物學(xué)改變方面，D-gal可以誘導(dǎo)大鼠內(nèi)耳組織線粒體DNA4834bp缺失突變 和肝臟線粒體DNA（mtDNA）的缺失。

D-gal模型現(xiàn)已被國內(nèi)學(xué)者廣泛應(yīng)用，它的優(yōu)點有：經(jīng)濟(jì)且操作簡單；模擬損傷較為全面；缺點是：飼養(yǎng)周期長、外界干擾因素較多，免疫方面的指標(biāo)與自然衰鼠還存在較大差異；D-gal用量、時間不統(tǒng)一也制約了該模型的發(fā)展。如何運用好D-gal模型并結(jié)合亞硝酸鈉、AL等神經(jīng)毒素聯(lián)合制作模型深入研究衰老機制和抗衰老藥物，將成為今后學(xué)者研究的新方向。

3 以膽堿能損傷為基礎(chǔ)的AD動物模型

大腦基底前腦膽堿能細(xì)胞損傷都可導(dǎo)致動物出現(xiàn)認(rèn)知障礙和學(xué)習(xí)記憶能力的損害。研究學(xué)者通過各種方法直接破壞腦膽堿能神經(jīng)細(xì)胞功能，從而制作AD模型。

3.1 電損傷基底核的AD動物模型

1991年宮斌 等以電損傷大鼠右半球中縫核群（1mA，30s）造成擬癡呆模型，結(jié)果證明直接使用電損傷基底核，明顯減少動物皮質(zhì)乙酰膽堿量，導(dǎo)致記憶障礙。2010年，宋興田等學(xué)者用電解毀損基底核法破壞腦基底核法制備SD大鼠損傷性癡呆模型，并利用電子顯微鏡觀察兩種癡呆模型的腦組織超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示模型鼠的腦神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均出現(xiàn)線粒體數(shù)目減少，嵴斷裂或消失，部分線粒體出現(xiàn)髓樣變或呈空泡狀。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少并出現(xiàn)脫顆粒，胞漿內(nèi)脂褐素顆粒增多。結(jié)果顯示腦神經(jīng)細(xì)胞的退行性變是癡呆模型的病變基礎(chǔ)。 實驗研究證明電解損傷基底核制備的模型可用作老年癡呆的動物模型，本模型也存在不足的缺陷，有待改進(jìn)。

3.2 化學(xué)損毀模型

有的學(xué)者使用化學(xué)物質(zhì)注入動物腦基底核，從而破壞膽堿能神經(jīng)元建立起AD模型。2000年，Sca1ic C 等學(xué)者將興奮性氨基酸如鵝膏蕈氨酸（ibotenic acid，IBO）等注入動物的基底大細(xì)胞核建立起AD模型，術(shù)后海馬神經(jīng)細(xì)胞明顯減少、學(xué)習(xí)記憶能力下降。2010年， 宋興田等學(xué)者用海人酸破壞腦基底核法制備SD 大鼠損傷性癡呆模型，并利用電子顯微鏡觀察癡呆模型的腦組織超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示模型鼠出現(xiàn)腦神經(jīng)細(xì)胞退行性病變。

此類模型簡單雖然模擬了膽堿能神經(jīng)元損傷的特征，但是模型未出現(xiàn)SP和NFT等病理性特征，所以在用藥劑量濃度和時間部位等問題上還需要進(jìn)一步研究。

4 注射A 的AD動物模型

A 在細(xì)胞基質(zhì)沉淀聚積后具有很強的神經(jīng)毒性作用，是導(dǎo)致AD病人腦內(nèi)老年斑周邊神經(jīng)元變性和死亡的主要原因。A 對AD神經(jīng)毒性作用主要表現(xiàn)在：破壞鈣的平衡；增強谷氨酸毒性；誘導(dǎo)一氧化氮和氧自由基的產(chǎn)生和神經(jīng)元凋亡；導(dǎo)致血管機能障礙；誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)等。因此，通過注射A 的方法也可制作AD動物模型。

2004年楊杰[16]等將 A 不同的片段注入大鼠腦內(nèi)，術(shù)后動物學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退，膽堿能神經(jīng)元死亡、突觸結(jié)構(gòu)減少，凋亡相關(guān)基因表達(dá)增加，并出現(xiàn) A 沉積。2006年，楊曉娟等將 A 25-35 5 l 注射于鼠側(cè)腦室基本模擬了 AD病理學(xué)特征。 2012年，Marcello E等通過實驗證明，A 不足可能會導(dǎo)致突觸失去正常功能，而A 過剩可能導(dǎo)致突觸功能障礙，從而導(dǎo)致AD的發(fā)生。

實驗證明，注射A 可模擬A 聚集或沉積學(xué)習(xí)記憶能力損害、海馬神經(jīng)元破壞等病理改變的AD動物模型。該模型適用于研究藥物對A 神經(jīng)毒性及AD的治療等方面的作用研究。

5 鋁元素慢性中毒模型

已有研究 證明，鋁是一種慢性神經(jīng)毒性物質(zhì)，血液中多余的鋁進(jìn)入腦內(nèi)后可損傷神經(jīng)元并誘導(dǎo)形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)和老年斑。2005年，楊勇等向大鼠脊髓蛛網(wǎng)膜下腔埋管多次注射三氯化鋁（aluminium trichloride，AlCl3）建立的 AD 動物模型 獲得成功。2011年，Xiao F等學(xué)者 利用D-gal與aluminium（AL）聯(lián)合皮下注射昆明小鼠連續(xù)10周，成功建立了一個學(xué)習(xí)記憶能力衰退并出現(xiàn)老年癡呆典型病理改變的模型，顯示利用鋁中毒制作老年癡呆模型已經(jīng)向復(fù)合模型方向發(fā)展了。

6 轉(zhuǎn)基因AD動物模型

隨著分子生物學(xué)方法及基因工程的發(fā)展，學(xué)者開始借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)將與 AD 相關(guān)的人類突變基因轉(zhuǎn)入動物中，通過改變動物遺傳學(xué)性狀來達(dá)到建立AD動物模型的目的。學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)APP （myloid beta （A4） precursor protein）基因突變會導(dǎo)致AD 發(fā)生。

1999年，Chen KS等初步的行為實驗發(fā)現(xiàn)PDAPP轉(zhuǎn)基因鼠學(xué)習(xí)和記憶受損。光線迷宮空間辨認(rèn)PDAPP轉(zhuǎn)基因鼠3～10月齡，表現(xiàn)出嚴(yán)重的缺損，而自發(fā)的物體辨認(rèn)行為表現(xiàn)為年齡依賴性下降，與淀粉沉積相關(guān)。 從2000至今十幾年間，Holtzman、Brion、Nilsson、Van der Haute、Lewsis、Oddo ～ 等學(xué)者利用不斷完善的轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立一個又一個轉(zhuǎn)基因AD動物模型，并從單轉(zhuǎn)基因向雙轉(zhuǎn)甚至三轉(zhuǎn)基因邁進(jìn)，這些轉(zhuǎn)基因模型可以在同一轉(zhuǎn)基因鼠內(nèi)同時表達(dá)AD的兩大特征性病理變化A 和NFT及AD其他的病理性特征。2012年，Zhang QL等學(xué)者利用APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和AL建立了一種更新的老年癡呆模型，實驗結(jié)果表明，動物模型的認(rèn)知能力的減少和神經(jīng)細(xì)胞的損失比野生組（WT）加鋁和單獨的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠更明顯， 表明了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠注入AL建模對老年癡呆病因與藥物治療研究有一定的潛在價值。2012年，F(xiàn)ilali M等 利用APP， PS1和 Mapt （3xTg-AD）建立三重轉(zhuǎn)基因小鼠來測試認(rèn)知和非認(rèn)知行為差異，這一模型將對臨床前期干預(yù)非常有幫助。

雖然轉(zhuǎn)基因動物模型在技術(shù)上仍有許多困難，但AD的多重轉(zhuǎn)基因模型日趨完善，獲得了能較完全體現(xiàn)AD兩大病理特征的小鼠品系。由于AD受遺傳及環(huán)境共同影響，因此在轉(zhuǎn)基因模型的基礎(chǔ)上，再施加中樞膽堿能損害、自身免疫損傷等其他致病因素，將產(chǎn)生更接近人類AD病理及發(fā)病過程的模型，從而將對AD治療及藥物的篩選開發(fā)起到推動作用。

7 與免疫有關(guān)的AD動物模型

近年來的研究 表明，老年人隨著年齡的增大AD患病率明顯增高，與自身免疫系統(tǒng)衰退有關(guān)，如老年斑中A 標(biāo)記和免疫球蛋白鏈相似，因而可以利用提取抗原-抗體復(fù)合物沉積形成淀粉樣核心導(dǎo)致神經(jīng)變性和老年斑形成，從而制備AD動物模型。此類模型的發(fā)展為AD的免疫調(diào)節(jié)治療開創(chuàng)了新的途徑。2010年， 等通過免疫具有聚合性淀粉樣變性（pABri）相關(guān)的肽序列同源性，蛋白質(zhì)構(gòu)象改變引起的體液免疫應(yīng)答減少了A 低聚物的水平從而減少AD的病理改變。

綜上所述，越來越多學(xué)者運用可造成氧化損傷或神經(jīng)損傷的物質(zhì)聯(lián)合D-gal建立老年癡呆模型，對實驗可起到事半功倍的效果。如前文提到的D-gal聯(lián)合亞硝酸鈉、AL、鐵等元素進(jìn)行造模，可以預(yù)見，將來會有更多這樣的復(fù)合模型會運用到老年癡呆動物模型的實驗中。

老年癡呆動物模型是多樣化的，各個模型驗證有關(guān)AD病因、發(fā)病機制等各種假說，都有其優(yōu)缺點，這些模型都有助于AD發(fā)病機制研究和治療藥物的篩選。其中D-gal為基礎(chǔ)的動物模型是最普遍的動物