欖香烯乳對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231及MCF-7凋亡的影響

殷玉琨，宋愛莉，孫子淵

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250014;2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

乳腺癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤的首位，且不斷上升，并有年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重危害婦女健康。雖然近年來(lái)其治療已取得長(zhǎng)足進(jìn)展，但一些惡性程度較高的類型及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的晚期患者預(yù)后較差。其中三陰性乳腺癌發(fā)病率約占乳腺癌所有類型發(fā)病率的17．27%［1］，且由于其生物學(xué)特性，對(duì)內(nèi)分泌治療不敏感［2］。尋找有效的治療藥物是目前研究的熱點(diǎn)之一。欖香烯乳系中藥莪術(shù)提取物，是我國(guó)具有獨(dú)立產(chǎn)權(quán)的抗癌新藥，對(duì)肺癌、肝癌、食管癌、鼻咽癌和婦科腫瘤等多種惡性腫瘤的體內(nèi)、外增殖具有抑制作用［3，4］，并可以增強(qiáng)臨床多種抗癌藥物的療效，降低放化療的毒副反應(yīng)［5，6］;臨床上主要用于介入、腔內(nèi)化療及癌性胸腹水的治療［7，8］，具有良好的應(yīng)用前景。但目前關(guān)于欖香烯乳作用于乳腺癌的效果及機(jī)制的研究較少。我們既往研究表明，莪術(shù)油(其主要抗腫瘤成分為欖香烯乳)可以降低乳腺癌及癌前病變?cè)炷４笫蟪闪雎?、腫瘤組織血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等［9，10］。2012年7 月 ～2013 年 1 月，我們?cè)诩韧芯康幕A(chǔ)上，觀察欖香烯乳對(duì)乳腺癌細(xì)胞株生長(zhǎng)及凋亡的影響，以探索欖香烯乳抗乳腺癌的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料 選用 ER、PR、HER-2均陰性的高侵襲乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231及ER陽(yáng)性、PR陽(yáng)性、HER-2陰性的低侵襲乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(英國(guó)卡迪夫大學(xué)外科系實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))。欖香烯乳注射液(100 mg/20 mL)購(gòu)自大連華立金港藥業(yè)有限公司(批號(hào):1207161)，胎牛血清和DMEM/Ham's F12購(gòu)自PAA Laboratories公司，Tri-reagent試劑、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及GAPDH 的Q-PCR引物均購(gòu)自Sigma公司。

1．2 方法

1．2．1 MDA-MB-231及MCF-7細(xì)胞系的培養(yǎng) 用含10%胎牛血清和DMEM/Ham's F12培養(yǎng)液在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．2．2 結(jié)晶紫法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)速率［11］將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231及MCF-7細(xì)胞接種于96孔板，每孔種2 000個(gè)細(xì)胞(200μL)，每組重復(fù)5孔，重復(fù)3板，分別標(biāo)記“0 h”、“48 h”和“96 h”。分別設(shè)空白對(duì)照組，及不同濃度的欖香烯乳處理組?？瞻讓?duì)照組加入欖香烯乳的普通培養(yǎng)基，欖香烯乳處理組分別加入終濃度含10、20、40、80、160 μg/mL 的欖香烯乳注射液的培養(yǎng)基。放入孵育箱培養(yǎng)(37℃、5%CO2、飽和濕度)，于種植后第 1 天(0 h)、第3天(48 h)、第4天(96 h)分別取出，去掉培養(yǎng)液，加入4%甲醛固定過(guò)夜，0．5%結(jié)晶紫染色10 min后沖洗晾干，10%醋酸溶液溶解后，置于540 nm分光光度計(jì)(BIO-TEK，ELx800)讀取吸光值(OD值)。細(xì)胞生長(zhǎng)速率表示為(OD48h或 OD96h－OD0h)/OD0h×100%。細(xì)胞抑制率表示為(1－OD處理組/OD對(duì)照組)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。應(yīng)用藥物濃度計(jì)算軟件(LOGIT法)計(jì)算中位抑制濃度(IC50)。

1．2．3 RNA提取及cDNA逆轉(zhuǎn)錄［12］標(biāo)記培養(yǎng)瓶MDA-MB-231或 MCF-7空白對(duì)照、欖香烯乳處理組，分別種植對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞1×106于培養(yǎng)瓶中，加入普通培養(yǎng)基孵育過(guò)夜(37℃、5%CO2、飽和濕度)。待細(xì)胞貼壁后，分別換入新鮮普通培養(yǎng)基或含40μg/mL欖香烯乳的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，顯微鏡下拍照記錄細(xì)胞形態(tài)。Tri-reagent試劑提取細(xì)胞RNA，質(zhì)量檢測(cè)后，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。

1．2．4 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 檢測(cè) 采用Q-PCR法［13］。分別取欖香烯乳處理后的及空白對(duì)照的MDA-MB-231細(xì)胞的cDNA，分別制備Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 及 GAPDH 的 Q-PCR 反應(yīng)液，應(yīng)用 Icycler IQ5 system(Bio-Rad，Hammel Hemstead，UK)Real-time PCR系統(tǒng)獲取不同組間的Caspase及內(nèi)參GAPDH的表達(dá)值。引物序列如下:Caspase-3正向引物為5'-GGCGTGTCATAAAATACCAG-3'，反向引物為5'-ACTGAACCTGACCGTACAACAAAGCGACTGGATGAA-3';Caspase-8正向引物為5'-AGAAAGGAGGAGATGGAAAG-3'，反 向 引 物 為5'-ACTGAACCTGACCGTACAGACCTCAATTCTGATCTGCT-3';Caspase-9正向引物為5'-AAGCCCAAGCTCTTTTTC-3'，反向引物為5'-ACTGAACCTGACCGTACAGTTACTGCCAGGGGACTC-3';GAPDH正向引物為5'-CTGAGTACGTCGTGGAGTC-3'，反向引物為5'-ACTGAACCTGACCGTACACAGAGATGACCCTTTG-3'。反應(yīng)條件如下:95℃15 min預(yù)變性，然后按95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s(共60個(gè)循環(huán))，最后72℃10 min延伸。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real-time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析:相對(duì)定量=目的基因的表達(dá)×內(nèi)參基因表達(dá)的修正比值。

1．2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用ˉx±s表示，計(jì)量資料的組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 欖香烯乳對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響 分別用不同終濃度的欖香烯乳處理細(xì)胞48、96 h后，與對(duì)照組(0μg/mL)比較，欖香烯乳濃度達(dá)到一定劑量時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率明顯下降，且呈時(shí)間—?jiǎng)┝恳蕾囆浴?8 h時(shí)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的IC50為58μg/mL，對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50為148μg/mL。見表1。

2．2 欖香烯乳對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 終濃度為40 μg/mL的欖香烯乳培養(yǎng)基處理 MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組比較，應(yīng)用欖香烯乳的細(xì)胞由黏附狀態(tài)變圓，細(xì)胞核固縮、崩解，可見凋亡小體，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡表現(xiàn)。見插頁(yè)Ⅰ圖1。2．3 欖香烯乳對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Caspase表達(dá)的影響 空白對(duì)照組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 表達(dá)量(×107拷貝量)分別為56．7 ±15．7、140．3±25．6、13．1 ±4．4，經(jīng)欖香烯乳處理后分別為812．2±222．6、327．8 ±50．1、5．7 ±1．5，與空白對(duì)照組比較，經(jīng)欖香烯乳處理后Caspase-3、Caspase-8表達(dá)量升高(P均＜0．05)，Caspase-9表達(dá)量無(wú)明顯變化(P＞0．05)。

表1 欖香烯乳對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響(%±s)

表1 欖香烯乳對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響(%±s)

注:與0 μg/mL 比較，*P ＜0．05，△P ＜0．01

欖香烯乳MDA-MB-231 MCF-7 48 h 96 h 0μ 48 h 96 h g/mL 252±13 641±11 404±50 1 022±111 10μg/mL 271± 9 624±29 451±64 1 178±100 20μg/mL 254± 9 540±29* 435±54 1 200± 96 40μg/mL 214±15 557±17△ 400±33 1 074± 51 80μg/mL 48±12△ 160±27△ 326±41 897± 69 160μg/mL －25± 5△ －45± 6△ 181±34* 277±137△

3 討論

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，目前以手術(shù)、化療、放療的綜合治療為主，但仍有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的治療失敗者，尤其三陰性乳腺癌對(duì)內(nèi)分泌治療不敏感，且目前缺乏相應(yīng)的靶向治療藥物。欖香烯乳作為Ⅱ類非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥，具有化療增敏、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥和提高機(jī)體免疫功能等多重作用，且不良反應(yīng)較輕，因而在乳腺癌的臨床治療上有良好的應(yīng)用前景。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，既往已進(jìn)行了欖香烯乳對(duì)多種惡性腫瘤的體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)，但針對(duì)欖香烯乳治療三陰性乳腺癌的效果及機(jī)制的報(bào)道較少。

既往研究證明，欖香烯乳可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡是其主要的途徑之一。本研究選擇ER陽(yáng)性、PR陽(yáng)性、Her-2陰性的低侵襲性細(xì)胞株MCF-7及ER、PR、Her-2均陰性的高侵襲性細(xì)胞株MDA-MB-231，采用欖香烯乳進(jìn)行干預(yù)觀察其對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)速率及凋亡誘導(dǎo)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)欖香烯乳達(dá)到一定濃度時(shí)，可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈濃度依賴性;相對(duì)于低侵襲性的MCF-7細(xì)胞系，對(duì)高侵襲性MDA-MB-231細(xì)胞系的抑制作用更為明顯;經(jīng)過(guò)欖香烯乳處理后，兩種細(xì)胞系均呈現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征;針對(duì)欖香烯乳作用后的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡因子的檢測(cè)顯示，欖香烯乳可能是通過(guò)誘導(dǎo)了乳腺癌細(xì)胞的凋亡從而達(dá)到抑制其生長(zhǎng)的作用。

細(xì)胞凋亡亦稱程序性細(xì)胞死亡，是一種受遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控的為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的細(xì)胞自殺過(guò)程。現(xiàn)代腫瘤學(xué)認(rèn)為，逃避免疫監(jiān)視是腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要機(jī)制之一。隨著對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡研究的深入，科研人員發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在腫瘤免疫逃逸中起著重要作用。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Caspases在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)過(guò)程中起關(guān)鍵作用［14］。細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格調(diào)控，在正常細(xì)胞Caspase處于非活化的酶原狀態(tài)，凋亡程序一旦開始，Caspase被激活，隨后凋亡蛋白酶的層疊級(jí)聯(lián)反應(yīng)以不可逆的形式發(fā)生。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn) Caspase家族至少有14個(gè)成員，其中Caspase-2、8、9、10、11 主要負(fù)責(zé)對(duì)執(zhí)行者的前體進(jìn)行切割，從而產(chǎn)生有活性的執(zhí)行者;Caspase-3、6、7主要負(fù)責(zé)切割細(xì)胞核內(nèi)、細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白。細(xì)胞凋亡的途徑有死亡受體路徑、線粒體路徑等。在死亡受體路徑中，Caspase-2、8被激活，最終激活其效應(yīng)器酶(通常Caspase-3)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［15］;在線粒體路徑中，Caspase-9被激活，然后激活下游的效應(yīng) Caspase 如 Caspase-2、3、6、7、8、10，啟動(dòng)Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡［16］。本研究中，經(jīng)欖香烯乳處理后的 MDA-MB-231細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8上調(diào)，而Caspase-9與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示欖香烯乳誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡，可能是通過(guò)死亡受體路徑引起的。

綜上所述，欖香烯乳抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，其可能機(jī)制是通過(guò)激活死亡受體途徑誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)研究提供了良好的前期基礎(chǔ)，同時(shí)也為臨床選擇三陰性乳腺癌治療方案提供了一些思路及實(shí)驗(yàn)支持。

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