急性肝功能不全小鼠對(duì)不同pH 值氨的耐受性

林麗萍，張金添，朱婷婷，李繼香，林麗晶，方夢(mèng)寒，林弘月，鄭劍聰

(莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院，福建 莆田 351100)

臨床中嚴(yán)重肝病患者，若出現(xiàn)上消化道大出血的并發(fā)癥，造成消化道內(nèi)蛋白質(zhì)的增多，可因細(xì)菌分解蛋白質(zhì)產(chǎn)氨增多;高蛋白飲食，未經(jīng)完全消化的蛋白成分在腸道潴留;肝硬變晚期合并腎功能障礙，通過腎臟排出的尿素減少，彌散入腸增加;以上因素均可使腸道的產(chǎn)氨量增加，誘發(fā)肝性腦病的發(fā)生［1］。因此，減少腸道氨的量及濃度可減少肝性腦病的發(fā)生發(fā)展［2］。本實(shí)驗(yàn)通過化學(xué)毒物四氯化碳制作小鼠急性肝功能不全模型［3］，觀察造模期間小鼠的生理變化及病理檢查變化［4］，給予不同pH 值氨的溶液后肝性腦病臨床表現(xiàn)出現(xiàn)的快慢及嚴(yán)重程度，以及急性肝功能不全小鼠對(duì)不同pH值氨的耐受性［5］。

1 試劑與材料

1.1 試劑

四氯化碳(分析純 中國(guó)東陽(yáng)化工廠)，植物油(市售花生油)，甲醛溶液(分析純 福建省三明市三圓化學(xué)試劑有限公司)

1.2 動(dòng)物

SD 小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)，體重約15～25 g，購(gòu)于福建疾病控制中心。標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲水不限。適應(yīng)喂養(yǎng)后開始實(shí)驗(yàn)。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組及處理

(1)隨機(jī)選取SD 小鼠50 只，隨機(jī)分為A、B、C、D、E 組，每組10 只，并標(biāo)記如A1、A2…A10 等，A、B、C、D 組造模做實(shí)驗(yàn)組，E 組正常喂食作為正常對(duì)照組，不做其他處理，直至取肝組織做病理;(2)將標(biāo)記好的小鼠稱重并按10 mL/kg 的劑量給予實(shí)驗(yàn)組小鼠0.4%四氯化碳花生油溶液，記錄注射時(shí)間并觀察注射后小鼠的一般狀態(tài);(3)距上次給藥后42 h 開始禁食6 h，再灌胃給予原劑量的0.4%四氯化碳花生油溶液; (4)24 h后，重復(fù)第(2)、(3)步;(5)并于6 h 后開始禁食6 h，再次稱量小鼠并記錄，再通過灌胃給予0.4%四氯化碳花生油溶液;(6)從末次給藥開始禁食不禁水16 h 后按0.5 mL/10g 分別腹腔注射給予A 組0.3 mol/L (pH =5)的氯化銨溶液、B 組pH=7 的氯化銨溶液、C 組pH =9 的氯化銨溶液、D 組pH=7 的生理鹽水溶液;(7)經(jīng)第6 步后觀察肝性腦病表現(xiàn)，再將實(shí)驗(yàn)組小鼠及對(duì)照組小鼠脊髓離斷處死，解剖取肝臟用10%甲醛溶液固定做病理切片檢查(HE 染色)。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)

觀察一般狀況: (1)造模期間小鼠的一般生理狀況及變化:包括毛色變化、飲食飲水狀況、排便排水、活動(dòng)等; (2)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的肝臟肉眼觀察及顯微病理變化;(3)給予不同pH 的氯化銨溶液后小鼠出現(xiàn)角膜消失、抽搐出現(xiàn)、樸翼樣震顫和角弓反張等臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度及快慢［4］2849－2851。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié) 果

3.1 一般生長(zhǎng)狀況

實(shí)驗(yàn)組小鼠造模期間總共死亡3 只，進(jìn)食減少，毛色黯淡，行動(dòng)遲緩，尿黃，有的小鼠體重減輕，總的體重增幅明顯小于正常對(duì)照組，正常對(duì)照組小鼠無死亡，生長(zhǎng)狀況良好，反應(yīng)靈敏，毛色光滑，飲食飲水排便正常。

3.2 給予不同pH 值的氯化銨溶液后結(jié)果如下。

3.2.1 一般狀況

實(shí)驗(yàn)組各組出現(xiàn)不同程度的興奮性先增高后降低如光聲刺激先增強(qiáng)后減弱，舔嘴、啄米樣動(dòng)作、作嘔表現(xiàn)，行動(dòng)遲緩且偶有跨閾步態(tài)，意識(shí)障礙，尿黃色乳糜狀，翻正反射消失，角膜反射消失，撲翼樣震顫，角弓反張，進(jìn)而出現(xiàn)死亡或癥狀轉(zhuǎn)緩等變化。A、B、C 組結(jié)果見表1，D 組雖有肝功能不全的模型基礎(chǔ)，但給予生理鹽水后無明顯異常，死亡率為零。

3.2.2 組織病理學(xué)檢查

(1)大體改變(圖1):①實(shí)驗(yàn)組:肝臟顏色變淺，質(zhì)地較堅(jiān)韌，表面凹凸不平有細(xì)小顆粒狀，無光澤，邊緣圓鈍，肝臟體積變小;②對(duì)照組:肝臟顏色鮮紅，肝緣銳利，肝實(shí)質(zhì)柔軟，表面光滑細(xì)膩有光澤;(2)肝組織病理切片HE 染色光鏡下觀察:①實(shí)驗(yàn)組:肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，可見局部肝實(shí)質(zhì)缺損，肝細(xì)胞壞死。肝細(xì)胞脂肪變性及水樣變性，匯管區(qū)及壞死區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn) (見圖2A、B);②對(duì)照組:肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列規(guī)整，無脂肪浸潤(rùn)，無變性壞死，匯管區(qū)無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖2C、D)。

表1 急性肝功能不全小鼠肝性腦病臨床表現(xiàn)的出現(xiàn)時(shí)間(，n=10)

3.3 急性肝功能不全小鼠肝性腦病臨床表現(xiàn)出現(xiàn)時(shí)間的方差分析

4 討 論

化學(xué)毒物四氯化碳可特異性引起肝損害，將其溶于植物油，經(jīng)灌胃及腹腔注射給藥制作急性肝功能不全模型［6］。四氯化碳造成肝細(xì)胞損傷的機(jī)制可能是自由基的形成及引發(fā)的鏈?zhǔn)竭^氧化反應(yīng)，產(chǎn)生自由基－ CCl3，發(fā)生脂質(zhì)過氧化，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)改變，溶酶體破裂和線粒體損傷及Ca2+通透變化，引起肝細(xì)胞急性損傷和破壞，再腹腔注射不同pH值的0.3 mol/L 的氯化銨溶液引起血氨急劇升高，在肝功能嚴(yán)重障礙的基礎(chǔ)上，一方面由于代謝障礙，ATP 不足以供給鳥氨酸循環(huán);另一方面，鳥氨酸循環(huán)的酶系統(tǒng)嚴(yán)重受損;以及鳥氨酸循環(huán)的各種底物缺失等均可使由氨合成尿素明顯減少，導(dǎo)致氨濃度增加［1］232－246。氨進(jìn)入腦內(nèi)與很多因素有關(guān)，氨屬于弱堿性，在血中主要以銨離子形式存在，正常情況下銨離子不易通過血腦屏障，當(dāng)血漿pH 增高時(shí)NH3增多，可自由通過血腦屏障，進(jìn)入腦內(nèi)［7］。進(jìn)入腦內(nèi)的氨增多一方面使腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)平衡失調(diào)，興奮性遞質(zhì)的量減少，而抑制性遞質(zhì)的量增多;另一方面氨增多會(huì)干擾腦細(xì)胞的能量代謝，導(dǎo)致腦細(xì)胞完成各種功能所需的能量嚴(yán)重不足，還影響到鈉鉀泵的活性，影響膜電位、細(xì)胞的興奮及傳導(dǎo)等活動(dòng)，所以pH 越高，氨通過血腦屏障越多，進(jìn)而表現(xiàn)出肝性腦病的臨床表現(xiàn)越嚴(yán)重［8］。

如實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，隨著A、B、C 組給予的氯化銨溶液pH 值的升高，各項(xiàng)癥狀出現(xiàn)的時(shí)間較早，且B、C 兩組的癥狀更為典型;C 組可能由于氨進(jìn)入腦內(nèi)的量更多，癥狀更嚴(yán)重，死亡率(70%)比A、B 兩組(分別為50%和60%)高，且可能由于病情比較嚴(yán)重，肝性腦病的癥狀并未全部表現(xiàn)出來便死亡。故提示血氨濃度越高，肝性腦病的程度將越重［9］。而D 組雖有肝功能衰竭的模型基礎(chǔ)，但給予生理鹽水后無明顯異常，死亡率為零，也提示血氨升高是誘導(dǎo)肝性腦病發(fā)生的重要因素。

由于小鼠的個(gè)體差異，所以給予不同pH 值的氯化銨后，有的小鼠在給藥后由于耐受性差，病情急劇發(fā)展較嚴(yán)重，未經(jīng)歷相關(guān)病程直接死亡或缺失相關(guān)癥狀而死亡;有些小鼠耐受性較好，經(jīng)歷相應(yīng)病程出現(xiàn)相應(yīng)癥狀后癥狀轉(zhuǎn)緩或死亡，故可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果未如預(yù)期理想。

綜上所述，四氯化碳可造成小鼠急性肝功能不全［10］，且急性肝功能不全小鼠對(duì)氨的耐受性隨著氯化銨溶液pH 值的升高而降低，肝功能不全癥狀表現(xiàn)的更嚴(yán)重。

圖1 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組肝臟病理大體觀

圖2 肝組織病理切片(HE 染色)

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