聚乙二醇－b－聚α－羥基辛酸載藥膠束的制備

劉曉娟，蔡東，王志偉，王浩

(遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

基于膠體制劑的滲透保留效應(yīng)的被動靶向是提高藥物治療指數(shù)的一種重要方法，這樣的膠體粒子表面是親水的并且盡可能避免血漿中調(diào)理素的結(jié)合，一般用親水的高分子對粒子表面進(jìn)行覆蓋或修飾。聚乙二醇是最常見的一類結(jié)構(gòu)簡單的親水高分子，直接將其與疏水鏈段鍵合后形成膠束是形成親水修飾粒子較簡單的方法之一［1－2］。

脂肪族聚酯是一類在藥劑學(xué)中非常重要的疏水高分子，其可作為微球、水凝膠、膠束、植入小棒、電紡纖維等多種藥物控制釋放系統(tǒng)［3］，現(xiàn)研究較多的為人工合成的α－羥基聚酯和ε－羥基聚酯［4］，此外還有β－羥基聚酯，γ－羥基聚酯等亦有所研究，但該兩者只能通過發(fā)酵方法制備很難控制聚合度重現(xiàn)性［5］。α－羥基脂肪酸可以通過開環(huán)聚合精確地控制分子量，但是現(xiàn)有的研究局限在分子中只有2、3 個碳原子的即聚乙醇酸，聚乳酸及其共聚物［6］，碳原子數(shù)較多的α－羥基聚酯的研究還較少，僅有數(shù)篇文獻(xiàn)報道［7－8］。本文合成聚乙二醇嵌段的聚α－羥基辛酸，親水與親脂部分嵌段比相等，可在水中形成膠束，并且試采用此高分子膠束包裹一系列常見的藥物，發(fā)現(xiàn)對蒿甲醚，α－亞麻酸兩者增溶效果好，且制備所得膠束在4 ℃，25℃和37 ℃條件下分別在4 d 和1 w 內(nèi)穩(wěn)定。

1 材料和儀器

3，6－二己基－1，4－二氧雜－2，5－二酮(辛交酯，純度＞98%，按文獻(xiàn)［9］合成)，聚乙二醇單甲氧基醚2000 (MePEG2000)， (Mw =2000，F(xiàn)luka 公 司，日 本);2－ 乙 基 己 酸 亞 錫 (Sn(OCt)2，Sigma 公司，純度＞95%，日本);甲苯(化學(xué)純，天津大茂化工有限公司);無水乙醇(分析純，天津大茂化工有限公司);丙酮(分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司)，三氯甲烷(分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司)，二氯甲烷(分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司)，正己烷(分析純，天津康科德化工有限公司)。蒿甲醚(上海DESANO公司，純度＞97%)，α－亞麻酸(按文獻(xiàn)［10］自制，純度＞98%)，吲哚美辛(寧波大紅鷹制藥，純度＞98%)，全反式維甲酸(山東良福制藥有限公司，純度＞98.5%)，布地奈德(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院有限公司，純度＞98%)，槲皮素(中國藥品生物制品檢定所，純度＞97.5%)，紫杉醇(上海DESANO 公司，純度＞98%)。

核磁共振光譜儀 (1HNMR，Bruker，300 MHz，美國)，凝膠滲透色譜(GPC，Wyatt Technology Inc.，DAWN HELEOS，Waters 泵，Shodex 804 凝膠柱，Optilab rEX 示差檢測器，美國)，場發(fā)射掃描電子顯微鏡(JSM－6301F，日本電子株式會社，分辨率1.5nm，加速電壓10 kV)，電熱套(ZDHW 型，河北黃驊中興儀器有限公司)，離心機(80－2 型，江蘇金壇中大儀器廠)，真空干燥箱(ZDF－6050 型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，旋片真空泵(ZXZ－2 型，浙江黃巖求精真空泵廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE－52ASHZ－Ⅲ型，上海亞榮生化儀器廠)，去離子水(1810－B 型石英自動雙重純水蒸餾器，江蘇金壇宏華儀器廠)，電冰箱(BCD－ 216YH 型，青島海爾股份有限公司)，高效液相色譜儀(包括UV－975 型紫外檢測器，PU－980 型泵，日本SHIMADZU 公司)，甲醇(色譜純，天津康科德化工有限公司)，乙腈(色譜純，天津康科德化工有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 聚乙二醇嵌段聚α－羥基辛酸的合成

圖1 聚乙二醇－b－聚α－羥基辛酸的開環(huán)聚合法制備過程

并加以改進(jìn)［9］，無水氮氣氛條件下將5 g 用無水乙酸乙酯重結(jié)晶的辛交酯置于干燥反應(yīng)瓶中，110 ℃磁力攪拌20 min 揮干殘余的水分和有機溶劑，將5 g 的MePEG2000 和2 滴催化劑Sn(Oct)2溶解在100 mL 無水甲苯溶液中后注入辛交酯的反應(yīng)瓶中并連接分水器。在120 ℃磁力攪拌條件下，反應(yīng)物呈溶液狀態(tài)并進(jìn)行開環(huán)聚合反應(yīng)，3 h 后停止加熱并旋蒸濃縮殘液至30 mL 左右，室溫下放冷后，將冷凍的1 ∶1 正己烷—乙醚混合液倒入并劇烈攪拌使聚合物析出。將此混合液在2000轉(zhuǎn)/min 條件下離心，棄去上清液將底部白色沉淀用冷的1 ∶1 正己烷—乙醚混合液再混懸，除去殘留的未反應(yīng)辛交酯，低聚合度產(chǎn)物和催化劑Sn(Oct)2，重復(fù)3 次后將底部白色沉淀在40 ℃真空抽干至恒重得純品PEG－PHO。

由圖2 和3 可知，得到了聚乙二醇嵌段的聚α－羥基辛酸，所得高分子的質(zhì)均分子量Mw，數(shù)均分子量Mn 和多分散系數(shù)PDI 由凝膠滲透色譜測定，以氯仿為流動相。結(jié)果為Mw:4.96 × 103，Mn:4.73 ×103，PDI 為1.07。

圖2 聚合度約為15 的聚乙二醇嵌段聚α－羥基辛酸的1H 核磁共振光譜

2.2 干膜—水化法制備載藥膠束及藥物增溶結(jié)果

制備膠束的方法較多，將干膜水化法是速度最快的一種，可用于篩選藥物與成膠束材料的親和性［11］。具體將PEG－PHO 溶解于丙酮中，可得到澄清，均一，透明，微帶淡藍(lán)色乳光的溶液。所選擇的藥物均溶解于丙酮，藥物溶解于丙酮中。所選藥物均溶解在丙酮中。將藥物和PEG－PHO 溶解在丙酮中形成無色均一的溶液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下，40℃，10 min 左右，蒸除溶劑，所有樣品均在瓶壁上形成無色，均一，透明，無泡點的薄膜，在室溫下用純凈水水化，可以發(fā)現(xiàn)載有蒿甲醚，α－亞麻酸和吲哚美辛的膠束溶液均為澄清，均一，透明，微帶淡藍(lán)色乳光的溶液，全無無固體物質(zhì)析出。

圖4 中A 和B 是兩種載藥膠束的顯微形態(tài)及其粒徑大小及分布測量結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，載有蒿甲醚的PEG－PHO 膠束外觀圓整，粒徑較小，平均約在90 nm;載有蒿甲醚的PEG－PHO 膠束外觀亦較圓整，但是由于α－亞麻酸可能是油狀物，PEG－PHO 作為一種表面活性劑對其增溶時與其的結(jié)合，粒徑較前者，平均約在170 nm。

圖3 聚乙二醇－b－聚α－羥基辛酸的凝膠滲透色譜圖

表1 PEG－POH 膠束增溶效果較好的藥物

圖4 載藥膠束的形態(tài)表征

圖4C 給出了溶解蒿甲醚后的膠束溶液外觀，可以發(fā)現(xiàn)溶液澄清，無沉淀析出，微顯淡藍(lán)色乳光，說明有膠體存在。同時，實驗中亦采用干膜—水化法制備了載有其它藥物的膠束，比如紫杉醇、全反式維甲酸、槲皮素、布地奈德、吲哚美辛等。這些載藥薄膜在藥物:PEG－ PHO 為3 ∶100 時，在水化后即有大量的白色沉淀析出，可能是未被溶解的藥物或藥物與PEG－PHO 的混合物析出。很明顯在這種制備方法下，藥物不能夠被很好地包裹，原因可能為這些化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)不適合包裹。觀察PEG－PHO 的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，PHO部分相當(dāng)于把正己烷鍵合到聚酯鏈上，能夠很好增溶的2 個化合物的結(jié)構(gòu)一個為醚萜類，一個為烷酸類，化學(xué)結(jié)構(gòu)相似故相溶，實際上，紫杉醇、槲皮素等化合物在水中的溶解度很低，在正己烷這種非極性有機溶劑中的溶解度也低。這也證明了聚酯側(cè)鏈的化學(xué)基團(tuán)性質(zhì)對藥物增溶有影響。

全反式維甲酸，布地奈德，槲皮素，紫杉醇等均難溶于水，分子中含有較多的雜原子，全反式維甲酸雖然具有一個環(huán)狀烷基端且整個分子雜原子所占比例較少，但長鏈部分為全反式的多共軛雙鍵結(jié)構(gòu)可能是影響其在膠束中增溶的原因之一;布地奈德整個分子雖為親脂性，但為4 個并聯(lián)環(huán)狀結(jié)構(gòu)能是影響其增溶的原因;槲皮素難溶于水，但在常見的有機溶劑中的溶解度尚可，分子中完全為芳香結(jié)構(gòu)，提示芳香結(jié)構(gòu)與n－己基側(cè)鏈的相容性很差，同樣的還有吲哚美辛可能也是由于分子中芳香結(jié)構(gòu)占主要比例所以增溶效果亦不佳，其在分子中的絕大部分是由5 個雙鍵和一個羰基形成的π－ π 結(jié)構(gòu)，所以在膠束內(nèi)核的包裹欠佳。藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)對其溶解性的影響以及非離子型表面活性劑對藥物的增溶的影響因素復(fù)雜［12－13］，本文僅作直觀觀察和簡單推測，具體原因還要通過其它方法進(jìn)一步闡釋和確證。

表2 PEG－POH 膠束增溶效果較差的藥物

這些化合物中，吲哚美辛可以以15 ∶100 的兩包裹在膠束中形成澄清溶液，但只能保持約30 min，隨后便逐漸析出大量的白色沉淀，取澄清狀態(tài)下的溶液迅速滴于載玻片上自然晾干后觀察可發(fā)現(xiàn)如圖5 中的結(jié)構(gòu)。

圖5 載有吲哚美辛的PEG－PHO 膠束

2.3 載蒿甲醚，α－亞麻酸和吲哚美辛膠束的含量穩(wěn)定性

理論上膠束為自發(fā)形成的熱力學(xué)穩(wěn)定體系，但載藥膠束會受到被包載藥物的影響而產(chǎn)生合并，絮凝等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致體系中沉淀的出現(xiàn)。評價載藥膠束穩(wěn)定性的方法很多，其物理穩(wěn)定性可以通過評價其粒徑隨時間變化的方法來實現(xiàn)［14］，但本法要求電子顯微鏡照片，對于長時間產(chǎn)生的大樣本實驗來說費時且成本極高。本實驗發(fā)現(xiàn)載藥膠束溶液在一段時間后會析出沉淀，故采用評價上清液中未析出藥物的含量占原有載藥量百分比隨時間變化的方法來評價其穩(wěn)定性，因為含量測定所需時間較短且成本較低。具體實驗方法為將15 ∶100 載藥量的蒿甲醚，α－亞麻酸和吲哚美辛的膠束避光置于4 ℃，25℃和37 ℃的環(huán)境下，在不同的時間點，觀察膠束溶液中是否有結(jié)晶或其它形態(tài)固體物質(zhì)析出，同時采用3000轉(zhuǎn)離心1 min 的方法將固體物質(zhì)離心后測定上清中液中藥物的含量，以其對時間作圖得圖6。

實驗中采用高效液相色譜－紫外分光光度法測定膠束中藥物含量，蒿甲醚流動相為甲醇/水=90/10;α－亞麻酸的流動相為乙腈/水=85/15;吲哚美辛的流動相為:6 mmol 磷酸/乙腈=50/50。其中三者均采用Diamonsil C18柱，柱長250 cm，填料粒徑5 μm，流動相的流速均為1 mL/min，檢測波長均為210 nm，柱溫均為35 ℃，測定時采用相應(yīng)流動相稀釋載藥膠束溶液。

圖6 不同溫度下，蒿甲醚(A)，α－亞麻酸(B)，吲哚美辛(C)PEG－PHO 膠束中的藥物含量隨儲存時間的變化

對于蒿甲醚膠束，含量在4 d 之后開始有明顯的下降，且體系中出現(xiàn)細(xì)小的結(jié)晶，該結(jié)晶在光線下能夠反光，2 w 后上清膠束中藥物含量小于初始含量的20%，容器底部含有較多結(jié)晶和白色絮狀物質(zhì);對于α－亞麻酸膠束，含量在7 d 之后開始有明顯的下降，同時體系中有細(xì)小白色絮狀物質(zhì)出現(xiàn)，2 w 后上清膠束中藥物含量均在50%以下，容器底部含有較多白色絮狀物質(zhì);對于吲哚美辛膠束，30 min 后體系中既有大量白色細(xì)小碎片狀物質(zhì)析出，1 h 后上清中吲哚美辛含量為初始含量的60%多左右，2 h 后只剩下20%多的藥物包裹在膠束中，24 h 后各個溫度下上清液中含量均不到原有的5%。

綜上，可以發(fā)現(xiàn)α－亞麻酸膠束較之蒿甲醚膠束含量大幅下降起始時間延后4 d，且下降的速率慢，并且在實驗結(jié)束點，仍然留在上清膠束中的藥物保存量也多。蒿甲醚膠束在25 ℃和37 ℃儲存溫度時較4 ℃儲存溫度時含量穩(wěn)定，而α－亞麻酸膠束相反。蒿甲醚膠束和α－亞麻酸膠束的含量穩(wěn)定性能維持?jǐn)?shù)天而吲哚美辛膠束只能夠維持?jǐn)?shù)小時。這些現(xiàn)象是由藥物本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定的，聚α－羥基辛酸相當(dāng)于把n－己烷連接在聚酯側(cè)鏈上，如果藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與n－己烷相容性差，則藥物很難增溶在聚α－羥基辛酸部位。蒿甲醚和β－欖香烯均為萜類化合物，前者分子中除氧原子外無雜原子，含有碳－碳鍵和醚鍵兩種親脂的化學(xué)鍵，后者分子中只含有碳－碳鍵并且無雜原子，是能夠溶解在n－己烷中的，而其它的化合物由于帶有雜環(huán)和環(huán)系，則在n－己烷中溶解度差而導(dǎo)致在聚α－羥基辛酸部位增溶效果差，小分子對藥物的溶解能力一定程度上決定其鍵合到高分子上后對藥物的溶解能力，這在以往的文獻(xiàn)中亦有所報道［15－16］。

3 討 論

3.1 根據(jù)本實驗可知除文獻(xiàn)報道的灰黃霉素外［8］417，PEG－PHO 所形成的膠束還對水難溶的蒿甲醚，α－亞麻酸有包載增溶作用，所形成的膠束分別為顆粒狀和液滴狀。盡管所形成的膠束僅能夠在數(shù)天內(nèi)穩(wěn)定，不能夠較長期保存，但可以使用時現(xiàn)用現(xiàn)配，即水化能夠長期保存的載藥干膜得到膠束溶液，故具有實用價值。

3.2 采用干膜—水化法制備載藥膠束時，該嵌段共聚物對全反式維甲酸，布地奈德，槲皮素，紫杉醇等的包裹能力較差。對吲哚美辛雖能包裹，但所得載藥膠束溶液在2 h 后內(nèi)析出將近80%的被載藥物，實用價值差。說明膠束內(nèi)核化學(xué)結(jié)構(gòu)對被載藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)有要求。分子中無共軛體系的化合物能夠被較好包裹，當(dāng)然此結(jié)論還有待繼續(xù)實驗加以充實。

3.3 本文采用的包裹藥物的方法為將嵌段共聚物/藥物/有機溶劑體系旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，值得注意的是這種方法可能并不是完好包裹藥物的一種較好方法，并且制備膠束不止干膜水化這一種方法，亦可以采用高分子/藥物混合有機溶液水透析法制備［10］202－204，而該方法下PEG－PHO 能否完好包裹本研究未被包裹的藥物需要進(jìn)一步的研究。

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