曲尼司特對(duì)STZ 糖尿病大鼠心肌的保護(hù)作用

姜宇，符麗娟

(遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

糖尿病心肌病指糖尿病患者心肌細(xì)胞原發(fā)性損傷引起廣泛的結(jié)構(gòu)異常，最終引起左心室肥厚及功能障礙的一種疾病狀態(tài)，心肌纖維化為其特征性病理變化。其發(fā)病機(jī)制至今未能完全闡明，血液流變學(xué)異常、腎素－血管緊張素系統(tǒng)(renin－angiotensin system，RAS)的過度激活、氧化應(yīng)激、晚期糖基化終末(AGEs)產(chǎn)物積聚以及細(xì)胞生長(zhǎng)因子的改變等多種因素均參與其發(fā)生發(fā)展［1－3］。其中心肌局部血管緊張素Ⅱ(angiotension Ⅱ，AngⅡ)的激活在其發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。曲尼司特(Tranilast，TNL)作為肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定藥，可能對(duì)糜酶的釋放及其介導(dǎo)的AngⅡ的生成起一定的抑制作用。本研究通過觀察曲尼斯特對(duì)糖尿病大鼠心臟結(jié)構(gòu)、血流動(dòng)力學(xué)變化以及對(duì)TGF－β1 蛋白表達(dá)的影響，旨在探討其對(duì)糖尿病心肌的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

健康雄性SD 大鼠40 只，體重250～300 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。曲尼司特購(gòu)自江蘇鹽城麥迪科化學(xué)品制造有限公司，鏈脲佐菌素購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，兔抗鼠TGF－β1 抗體購(gòu)自Santa Cruz 公司，DH150 動(dòng)物人工呼吸機(jī)購(gòu)自浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器公司。

1.2 糖尿病模型制備及分組

健康雄性SD 大鼠40 只(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重250～300 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)抽取10 只為正常對(duì)照組(NC)，余30 只一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg 制備糖尿病大鼠模型，72 h 后尾靜脈取血，測(cè)血糖，以血糖≥16.7 mmol/L、尿糖陽性者定為糖尿病模型。將成模大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組(DM)、曲尼司特100 mg/ (kg·d)劑量組(Tra1)及200 mg/ (kg·d)劑量組(Tra2)各10 只，DM 組及NC 組給予等量生理鹽水灌胃，飼養(yǎng)12 w。

1.3 血糖測(cè)定

大鼠尾靜脈采血，用SureStep Plus 型血糖儀于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前檢測(cè)空腹血糖。

1.4 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

用20%烏拉坦腹腔麻醉大鼠，插管到左心室觀察壓力波形變化，通過壓力換能器記錄左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左室內(nèi)壓最大下降速率(－dp/dtmax)。

1.5 心臟質(zhì)量指數(shù)檢測(cè)及心室標(biāo)本采集

開胸取出心臟，分別稱取心臟重量 (heart weight，HW)及左室重量(left ventricular heavy，LVH)，計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù) (LVMI) = LVH/BW。然后將左室心肌一半置于40 g·L－1多聚甲醛(pH 7.4)中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，制作切片。

1.6 心肌病理形態(tài)學(xué)及膠原容積分?jǐn)?shù)測(cè)定(Masson 染色)

取左心室心肌組織，用10% 甲醛溶液固定，常規(guī)方法石蠟切片MASSON 染色，光鏡下觀察心肌細(xì)胞呈紅色或黃色，膠原纖維呈藍(lán)綠色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色。各組隨機(jī)選取5 只大鼠，每只大鼠隨機(jī)取5 張左室心肌切片，每張切片在統(tǒng)一放大倍數(shù)下(×400)隨機(jī)選取10 個(gè)視野鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化及測(cè)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù) (CVF)(%)。

1.7 免疫組化法檢測(cè)左室心肌TGF－β1 蛋白表達(dá)

石蠟防脫切片60 ℃烤片90 min，常規(guī)二甲苯，梯度酒精脫蠟至水洗;0.1 M 枸櫞酸緩沖液140 ℃2 min 進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻30 min;滴加10%正常山羊血清封閉游離的結(jié)合位點(diǎn)，于室溫放置20 min;甩去多余液體，滴加適當(dāng)稀釋的Ⅰ抗，于4 ℃冰箱過夜;滴加生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，37 ℃20 min，PBS 洗3 次;滴加試劑SABC 37 ℃30 min，PBS 洗3 次;DAB 顯色;蘇木素輕度復(fù)染;脫水，透明，封片，鏡檢。陰性對(duì)照用PBS 代替Ⅰ抗。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況及血糖水平

實(shí)驗(yàn)過程中NC 組大鼠精神狀況、飲食、飲水情況良好。DM 組大鼠呈現(xiàn)明顯精神萎靡、活動(dòng)差、反應(yīng)遲鈍，飲食飲水量下降。曲尼司特低、高劑量組大鼠一般情況優(yōu)于DM 組，多飲、多食、多尿、消瘦表現(xiàn)減輕。與NC 組相比，DM 組大鼠血糖明顯升高(見表1)(P ＜0.01)。

2.2 各組大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化

與NC 組相比，DM 組大鼠+dp/dtmax和－dp/dtmax均顯著降低(P ＜0.01);與DM 組相比，曲尼司特各劑量組大鼠+dp/dtmax和－dp/dtmax有不同程度的升高(P ＜0.05，見表2)。

2.3 各組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)變化

與NC 組相比，DM 組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)顯著增加(P ＜0.01);與DM 組相比，曲尼司特各劑量組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)降低(P ＜0.01，見表3)。

2.4 各組大鼠左室心肌Masson 染色結(jié)果及心肌膠原容積分?jǐn)?shù)變化

NC 組心肌纖維完整，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，膠原纖維分布稀疏。DM 組肌纖維排列紊亂，心肌間質(zhì)及血管周圍膠原纖維明顯增多。與DM 組相比，曲尼司特各劑量肌纖維排列基本規(guī)則，膠原纖維分布較稀疏(見圖1)。與NC 組比較，DM 組膠原容積分?jǐn)?shù)顯著升高(P ＜0.01);與DM 組相比，曲尼司特各劑量組膠原容積分?jǐn)?shù)有不同程度的降低(P ＜0.01)，高劑量組降低更為明顯(P ＜0.01，見表4)。

表1 曲尼司特對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響()

表2 曲尼司特對(duì)糖尿病大鼠血流動(dòng)力學(xué)變化的影響(，n=8)

表3 曲尼司特對(duì)糖尿病大鼠體重及心臟質(zhì)量指數(shù)的影響(，n=8)

表4 各組大鼠心肌膠原容積分?jǐn)?shù)的比較(，n=8)

2.5 各組大鼠左室心肌TGF－β1 蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)法)

TGF－β1 蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞胞漿呈黃色或棕黃色，TGF－β1 在NC 組大鼠左室心肌細(xì)胞胞漿中略有表達(dá)，呈弱陽性。DM 組心肌細(xì)胞胞漿均有TGF－β1 染色顆粒(呈深棕黃色)，為強(qiáng)陽性;與DM 組相比，曲尼司特各劑量組TGF－ β1 和Bax在心肌組織表達(dá)減少(見圖2)。

3 討 論

糖尿病心肌病主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞增生、肥大、凋亡和間質(zhì)膠原沉積，其中心肌纖維化是糖尿病心肌病的特征性改變［4］。本實(shí)驗(yàn)建立STZ 糖尿病大鼠模型，觀察曲尼司特對(duì)糖尿病大鼠心肌損傷是否具有保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)大鼠注射STZ 后血糖一直在較高水平波動(dòng)，病程12 w 出現(xiàn)明顯多飲多尿、精神萎靡、體重降低癥狀。此時(shí)糖尿病大鼠心臟重量指數(shù)顯著增高，表明已出現(xiàn)心肌肥厚，同時(shí)心肌膠原纖維增多，大鼠心臟舒張、收縮功能均出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為－dp/dtmax比值明顯降低。經(jīng)曲尼司特干預(yù)后，曲尼司特組大鼠心臟重量指數(shù)顯著下降，心肌膠原纖維減少，±dp/dtmax顯著升高，提示曲尼司特可抑制心肌纖維化，改善糖尿病心臟功能。

近年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子分泌增多參與了糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展，其中TGF－β1 參與了心肌纖維化發(fā)生的早期過程。TGF－ βl 屬TGF－ β 超家族，是一種多功能的細(xì)胞間信號(hào)蛋白，調(diào)節(jié)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在細(xì)胞增殖、識(shí)別、凋亡、特殊分化及細(xì)胞外基質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)［5－8］TGF－β1 及其受體在心臟的心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞均有表達(dá)，在心肌梗死及多種心肌病等心臟病理生理狀態(tài)下，均存在TGF－βl 的過度表達(dá)，與心室的重構(gòu)密切相關(guān)。在糖尿病心肌組織中TGF－β1 含量也明顯增多［9］。提示TGF－βl 的過度表達(dá)及通過激活其下游信號(hào)分子和激酶，可能參與了糖尿病心肌病的發(fā)病過程。本實(shí)驗(yàn)病程12 周時(shí)DM 組大鼠TGFβ1 蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示TGFβ1 蛋白高表達(dá)與糖尿病心肌纖維化有關(guān)。

曲尼司特為肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑，其主要作用機(jī)理為抑制肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞的磷酸二脂酶，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷的水平升高，進(jìn)入細(xì)胞的游離鈣減少，穩(wěn)定細(xì)胞膜，防止其細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺等化學(xué)介質(zhì)。最初作為抗過敏藥廣泛應(yīng)用于變態(tài)反應(yīng)性疾病如支氣管哮喘和過敏性鼻炎的治療［10］。近年研究發(fā)現(xiàn)曲尼司特有抗纖維化的作用。其抗纖維化的具體機(jī)制尚不明了，可能的機(jī)制為: (1)調(diào)節(jié)膠原合成代謝過程;(2)抑制TGFβ1 的產(chǎn)生及其所誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生與合成。本研究顯示，與DM 組相比，經(jīng)過曲尼司特干預(yù)后的大鼠TGFβ1 蛋白表達(dá)水平明顯下降，提示曲尼司特可以影響TGFβl 信號(hào)通路活化，下調(diào)TGFβl 的表達(dá)。

綜上所述，曲尼司特可有效抑制糖尿病大鼠的心肌纖維化水平，改善心室重構(gòu)，進(jìn)而改善心臟功能，對(duì)糖尿病大鼠心肌組織具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與下調(diào)TGFβ1，表達(dá)有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖1 心肌Masson 染色(×400)

圖2 左室心肌TGF－β1 蛋白表達(dá)(×200)

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